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流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2 疫苗学
流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2
基因稳定性研究
李玉华李海玲吴永林陈宣洪黄玉仙俞永新保井孝太郎
【摘要】目的通过研究流行性乙型脑炎活疫苗减毒株基因稳定性,从分子水平证实流行性
乙型脑炎活疫苗的遗传稳定性.方法分析流行性乙型脑炎活疫苗主种子,工作种子及其相应的疫
苗病毒E蛋白基因核苷酸和氨基酸序列,并与其强毒株和基因库中乙脑病毒减毒株(AF315119)比较.
结果乙脑活疫苗主种子,工作种子及其相应的疫苗病毒的E蛋白基因核苷酸序列完全相同.这些
病毒E蛋白的氨基酸序列与基因库中乙脑病毒弱毒株(AF315119)比较显示第E447位点氨基酸有差
异.结论乙脑病毒活疫苗减毒株遗传学特性稳定.
【关键词】乙型脑炎减毒株;基因稳定性;E蛋白
GeneticstabilityofattenuatedJapaneseencephalitisvirusSA14-14-2LIYu-hua*,LIHai-ling,WUYong-
lin,CHENXuan-hong,HUANGYu-xian,YUYong-xin,KotaroYasui.*DepartmentofViralVaccine,Chengdu
InstituteofBiologicalProducts,Chengdu610063,China
Correspondingauthor:LIYu-hua,E-mail:liyuhua hotmail.com
【Abstract】ObjectiveToinvestigategeneticstabilityofattenuatedJapaneseencephalitisvirusSA14-14-
2.MethodsThenucleotidesequencesofEproteinofmasterseedvirus,workingseedvirusandvaccinestrainof
Japaneseencephalitisvirus(JEV)SA14-14-2weredeterminedandcomparedwiththoseofJEVattenuatedstrainin
additiontovirulentstrainSA14.ResultsNucleotideacidandaminoacidsequencesofEproteinofthoseJEVs
areidentical.AminoacidsequencecomparisonofthoseJEVswithSA14-14-2indicatethatthereisonlyoneamino
aciddifferentatE447.ConclusionJEVattenuatedstrainSA14-14-2isgeneticallystableandsafe.
【Keywords】Japaneseencephalitisvaccine;VaccinestrainSA14-14-2;Geneticstability;Eprotein
作者单位:成都生物制品研究所(李玉华,李海玲,吴永林,陈宣
洪,黄玉仙);中国药品生物制品检定所(俞永新);日本国东京都神经
科学综合研究所(保井孝太郎)
通讯作者:李玉华,610063成都生物制品研究所(E-mail:liyuhua
@hotmail.com)
流行性乙型脑炎病毒是引起人类严重疾病的
黄病毒属中的一个成员,该病是亚洲病毒性脑炎的
主要病因.在流行地区,临床疾病年发病率为10/10
万～100/10万,病死率平均为30%,临床症状较重的
存活者伴有永久性神经,精神病后遗症〔1〕.最近几
年,在以前没有乙脑流行的地区如澳大利亚也有了
乙脑病毒感染的报道〔2〕,预防和控制该病尤为重要.
目前,世界范围内,有3种疫苗存在:鼠脑纯化疫
苗〔3〕,地鼠肾细胞灭活疫苗,地鼠肾细胞活疫苗〔4〕.
鼠脑纯化疫苗获得了世界范围内使用的许可,但是,
该疫苗本身所存在的问题如:可能发生严重的过敏
反应,生产工艺复杂,价格昂贵〔3〕,有必要开发更安
全,有效,价廉的乙脑疫苗.
原代地鼠肾细胞活疫苗经过10多年约2亿儿
童使用后,临床结果显示该疫苗有安全,免疫原性
好,副反应小等优点〔5〕.在中国和世界上的部分国
家,乙脑活疫苗对控制流行性乙型脑炎的流行正起
着很好的作用〔6,7〕.同时,乙脑病毒活疫苗主种子和
生产疫苗用的原代地鼠肾细胞经过英国安全实验室
(Q-oneBiolab)检定,结果表明乙脑活疫苗病毒主种
子和原代地鼠肾细胞无与地鼠,啮齿类动物,人,牛,
猪有关的外源病毒污染〔5〕.现在,世界卫生组织已
将原代地鼠肾细胞活疫苗免疫作为控制和预防乙型
脑炎的重要手段,推广使用乙脑活疫苗,研究乙脑活
疫苗病毒SA14-14-2基因稳定性,从分子水平论证乙
脑活疫苗的安全性是大家关注的焦点,有重要意义.
材料和方法
病毒:流行性乙型脑炎活疫苗病毒主种子SA14-
14-2(JEV-MVS5)为乙脑活疫苗原始种子在原代地鼠
肾细胞培养的第5代病毒;流行性乙型脑炎活疫苗
病毒工作种子SA14-14-2PHK6(JEV-WS6)为主种子
在原代地鼠肾细胞培养的第6代病毒.流行性乙型
858 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
脑炎活疫苗病毒SA14-14-2PHK7(JEV-V)是工作种
子在原代地鼠肾细胞培养的第7代病毒,批号为
20011085.
RNA抽提:采用德国Mannheim公司HighPure
ViralRNAKit,以说明书的方法提取病毒RNA.
cDNA合成和PCR扩增:根据基因库中登录的
流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2核苷酸序列
设计本实验所需引物,由TaKaRa公司合成.上游引
物(5''-GTCAACGCGTGGTATTTACC-3''),下游引物(5''-
TCCACCCAGGCTTCCACGTC-3'').用InvitrogenTMlife
Technologies公司SUPERSCRIPTTMFirst-StrandSynthesis
SystemforRT-PCR试剂合成第一条cDNA,即于0.2ml
管中,依次加入以下各液并充分混匀:10×RTbuffer
2 l,25mmol/LMgCl
2
4 l,10mmol/LdNTP1 l,引物
2 l,DTT2 l,RNasin1 l,RNA7 l,SuperscriptⅡ1 l,
42℃1h.加入RNaseH,37℃15min,95℃5min.
PCR扩增采用TaKaRa公司的TaKaRaRNALAPCRTM
Kit,依次加入10×LAbuffer10 l,25mmol/LMgCl
2
10 l,2.5mmol/LdNTP16 l,上,下游引物各1 l,cD-
NA0.5ml,Taq-p1 l.94℃2min,94℃30s,55℃30
s,72℃30s,30个循环.72℃延伸5min.
PCR产物的纯化:采用Omega公司的E.Z.A○R
Cycle-pureKit,按说明书方法回收纯化目的片段.
核苷酸序列分析:采用双脱氧链终止法.由
TaKaRa公司利用ABIPRISMBigDyeTMTerminatorCycle
SequencingReadyReaction试剂盒和ABIPRISMTM377XL
DNA序列分析仪测定核苷酸序列.
结果
1.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子和乙脑活
疫苗病毒E蛋白由1500个核苷酸组成,编码500个
氨基酸(见图1).
2.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子与活疫苗
病毒及基因库中登录的JEV(AF315119)E蛋白核苷
酸比较:图2显示乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子
及活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列完全相同,与
乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(AF315119)E蛋白核苷
酸序列比较,E1340位点上核苷酸不同(G→A),同
源性为99.9%.
3.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及活疫苗
病毒和基因库中JEV(AF315119)E蛋白上氨基酸比
较:图3表明编码乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子
和疫苗病毒的E蛋白氨基酸序列完全相同,与基因
库中乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(AF315119)E蛋白氨
图1乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子和乙脑活疫苗
病毒E蛋白核苷酸组成
Fig1.NucleotidesequenceencodingEproteinofmaster
seed,workingseedanditscorrespondingvaccineofJEVlive-at-
tenuatedvaccine
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图2乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子与活疫苗病毒
及基因库中登录的JEV(AF315119)E蛋白核苷酸比较
Fig2.NucleotidecomparisonofEproteingeneofJEV
masterseed,workingseedandvaccineviruswiththesequence
ofJEVSA14-14-2intheGenBank(AF315119)
基酸序列相比,E447位点氨基酸发生了改变(G→
D),同源性为99.8%.
4.乙脑病毒活疫苗株(SA14-14-2)与其亲代强
毒株SA14基因中编码E蛋白的关键氨基酸比较:根
据文献报道,乙脑病毒减毒株SA14-14-2与其亲代强
毒株SA14的E蛋白基因中存在9个氨基酸差异,其
中E138,E176,E315,E439位点氨基酸在乙脑病毒强
毒株SA14减毒过程中起最重要作用〔8,9〕.本研究中
SA14-14-2主种子,工作种子和活疫苗病毒与乙脑强
毒株比较均发生了9个氨基酸的变异,毒种与疫苗
间无差异,结果见表1.讨论
E蛋白是乙脑病毒的重要抗原,含有与病毒毒
力密切相关的决定性氨基酸〔10,11〕,能诱导产生中和
抗体〔12-14〕.已有研究表明,黄病毒属病毒强弱毒株
间如黄热病毒Asibi/17D〔15〕,乙型脑炎病毒SA14/
SA14-14-2〔16〕,AT31/at222〔17〕E蛋白基因的关键氨基
图3乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及活疫苗病毒
和基因库中JEV(AF315119)E蛋白上氨基酸比较
Fig3.ComparisonofaminoacidofEproteinofmaster
seedvirus,workingseedvirusanditscorrespondingvaccine
withthatofJEVSA14-14-2fromGenBank
表1乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子,疫苗,基因库
中乙脑病毒弱毒株与乙脑病毒强毒株SA14E蛋白基因中氨
基酸比较
Table1.ComparisonofaminoaciddifferenceinEprotein
ofJEVSA14-14-2masterseedvirus,workingseedvirusand
vaccineviruswiththatofJEattenuatedstrain(AF315119)in
GenBankanditsvirulentstrainSA14
ntΔaa▲
Master
seedvirus
Working
seedvirus
Vaccine
virus
SA14-14-2PHK7
AF315119*
SA14#
1296E-107FFFPhe(F)Leu(L)
1389E-138KKKLys(K)Glu(E)
1503E-176VVVVal(V)Ile(I)
1506E-177AAAAla(A)Thr(T)
1769E-264HHHHis(H)Gln(Q)
1813E-279MMMMet(M)Lys(K)
1921E-315VVVVal(V)Ala(A)
1977E-334PPPPro(P)Ser(S)
2293E-439RRRArg(R)Lys(K)
ΔIndicatednucleotide;▲indicatedaminoacid;*indicatestheaminoacidsof
SA14-14-2inGenBankpublicatedbyZengmingetal;#referstotheaminoacidsofJEV
virulentstrainSA14inGenBankanalyzedbyAihara
酸的变化与乙脑病毒毒力改变或者强毒株毒力减弱
密切相关.因此,分析乙脑病毒活疫苗减毒株E蛋
068 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
白的分子生物学特性对研究乙脑活疫苗病毒基因稳
定性有重要意义.
乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及其疫苗病
毒的E蛋白由1500个核苷酸组成,编码500个氨基
酸,与以往报道的乙脑病毒其它毒株E蛋白核苷酸
序列一致〔16-20〕.主种子,工作种子及其疫苗病毒的
E蛋白基因核苷酸及氨基酸序列完全一致,表明从
主种子代,工作种子代至疫苗时,基因是稳定的.
与乙脑病毒弱毒株SA14-14-2核苷酸序列比较,
虽然与基因库AF315119比较在E蛋白第1340位点
核苷酸及相应的E447位点氨基酸有不同,但是,与
基因库中另一乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(D90915)〔8〕
及范行良〔21〕等报道的乙脑病毒弱毒株SA14-14-2的
核苷酸序列则完全一致.个别核苷酸的改变可能与
操作过程有关.另外,乙脑病毒E蛋白基因中和减
毒有关的氨基酸是E138,E176,E315,E439〔22〕.本研
究显示,在乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及其疫
苗病毒的E蛋白基因中,这些氨基酸均未发生改变,
与乙脑病毒弱毒株的序列(AF315119,D90915)一致.
与乙脑强毒株SA14比较,本研究的乙脑活疫苗病
毒,工作种子和主种子E蛋白基因关键氨基酸与乙
脑病毒其它强毒株间氨基酸有一致性的差异(表1),
表明SA14-14-2株乙脑活疫苗在生产过程中的基因
稳定性,乙脑活疫苗对小鼠脑内毒力十分稳定与其
基因稳定性密切相关〔23〕.从分子水平证明了用该
毒株制备活疫苗的安全性.
参考文献
1KuraneI,TakasakiT.Immunogenicityandprotectiveefficacyofthecur-
rentinactivatedJapaneseencephalitisvaccineagainstdifferentJapanese
encephalitisvirusstrains.Vaccine,2000,18(Supplement2):33-35.
2MackenzieJS.TheecologyofJapaneseencephalitisvirusintheAustralian
region.ClinVirol,1999,27:1-7.
3TsaiTF.NewinitiativesofthecontrolofJapaneseencephalitisbyvaccina-
tion:MinutesofaWHO/CVImeeting,Bangkok,13-15October1998.
Vaccine,2000,18(Supplement2):1-25.
4YuYX,ZhangGM,GaoYP,etal.SafetyofaliveattenuatedJapanese
encephalitisvirusvaccine(SA14-14-2)forchildren.AmericanJournalof
TropicalMedicineandHygiene,1988,39:214-217.
5YuYX,ShinSH.Progressinqualitycontrolandproductionofliveatten-
uatedvaccineinChina.MeetingoftheWHOsteeringcommitteeon
DENGUE/JEvaccines.Geneva9-10April2002.
6ZhouBL,JiaLL,XuXL,etal.Alarge-scalestudyonthesafetyand
epidemiologicalefficacyofJapaneseencephalitis(JE)livevaccine(SA14-
14-2)intheJEendemicareas.ChinJEpidemiol,1999,20(1):38-41.
7BistaMB,BanerjeeMK,ShinSH,etal.Efficacyofsingle-doseSA14-
14-2vaccineagainstJapaneseencephalitis:Acasecontrolstudy.The
Lancet,2001,358(8):791-795.
8AiharaS,RaoC,YuYX,etal.Identificationofmutationsthatoccurred
onthegenomeofJapaneseencephalitisvirusduringtheattenuationpro-
cess.VirusGenes,1991,5:95-109.
9曾明,俞永新,董关木,等.乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株
SA14-14-2基因组全序列的测定.中华微生物学和免疫学杂志,
2001,21(5):535-539.
10NiH,ChangGJ,XieH,etal.Molecularbasisofattenuationofneu-
rovirulenceofwild-typeJapaneseencephalitisvirusstrainSA14.JGen
Virol,1995,76:409-413.
11SumiyoshiH,TignorGH,ShopeRE.Characterizationofahighlyattenu-
atedJapaneseencephalitisvirusgeneratedfrommolecularlyclonedcDNA.
JInfectDis,1995,171(4):1144-1151.
12Kimura-kuradaJ.YasuiK.AntigeniccomparisonofenvelopeproteinE
betweenJapaneseencephalitisvirusandsomeotherflavivirusesusingmon-
oclonalantibodies.JGenVirol,1986,67:2663-2672.
13Kimura-kuradaJ,YasuiK.ProtectionofmiceagainstJapaneseen-
cephalitisvirusbypassiveadministrationwithmonoclonalantibodies.J
Immunol,1988,141:3606-3610.
14YasudaA,Kimura-kuradaJ,OgimotoM,etal.Inductionofprotective
immunityinanimalvaccinatedwithrecombinantvacciniavirusesthatex-
pressprMandEglycoproteinofJapaneseencephalitisvirus.JVirol,
1990,64:2788-2795.
15HahnCS,DalrympleJM,StraussJH,etal.Comparisonofthevirulent
AsibistrainofYellowfeverviruswiththe17Dvaccinederivedfromit.
ProcNatlAcadSciUSA,1987,84:2019-2023.
16NitayaphanS,GrantJA,ChangGJ,etal.Nucleotidesequenceofthe
virulentSA14strainofJapaneseencephalitisvirusanditsattenuatedvac-
cinederivative,SA14-14-2.Virology,1990,177:541-552.
17LiYH,WakitaT,YasuiK.Genomeregionresponsibleforthepathogeni-
sisofJapaneseencephalitisvirus.4thJapan-Chinavirologycongressheld
inKunming,China28-29July2002.
18SumiyoshiH,MoriC,FukeI,etal.Completenucleotidesequenceof
theJapaneseencephalitisvirusgenomeRNA.Virology,1987,161:497-
510.
19MarlouN,MangadaT,TakagamiT.Molecularcharacterizationofthe
JapaneseencephalitisvirusrepresentativeimmunotypestrainJaGAr01.
VirusResearch,1999,59:101-112.
20HashimotoH,NomotoA,WatebabeK,etal.Molecularcloningand
completenucleotidesequenceofthegenomeofJapaneseencephalitisvirus
Beijing-1strain.VirusGenes,1988,1:305-317.
21范行良,俞永新,李德富,等.乙型脑炎病毒野毒株及其不同减
毒株E蛋白基因序列比较.中国病毒学,2002,17(3):216-220.
22WaltonEM,ShopeRE,BlankFl.Studyofneurovirulencelocusof
Japaneseencephalitisvirus.ⅩⅣthInternationalCongressforTropical
MedicineandMalaria.1994,p124.
23俞永新.流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2减毒株的表型和
基因型特性及其稳定性.中国计划免疫,2002,8(5):283-287.
(收稿日期:2003-04-04)
168 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
391398
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流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2
基因稳定性研究
李玉华李海玲吴永林陈宣洪黄玉仙俞永新保井孝太郎
【摘要】目的通过研究流行性乙型脑炎活疫苗减毒株基因稳定性,从分子水平证实流行性
乙型脑炎活疫苗的遗传稳定性.方法分析流行性乙型脑炎活疫苗主种子,工作种子及其相应的疫
苗病毒E蛋白基因核苷酸和氨基酸序列,并与其强毒株和基因库中乙脑病毒减毒株(AF315119)比较.
结果乙脑活疫苗主种子,工作种子及其相应的疫苗病毒的E蛋白基因核苷酸序列完全相同.这些
病毒E蛋白的氨基酸序列与基因库中乙脑病毒弱毒株(AF315119)比较显示第E447位点氨基酸有差
异.结论乙脑病毒活疫苗减毒株遗传学特性稳定.
【关键词】乙型脑炎减毒株;基因稳定性;E蛋白
GeneticstabilityofattenuatedJapaneseencephalitisvirusSA14-14-2LIYu-hua*,LIHai-ling,WUYong-
lin,CHENXuan-hong,HUANGYu-xian,YUYong-xin,KotaroYasui.*DepartmentofViralVaccine,Chengdu
InstituteofBiologicalProducts,Chengdu610063,China
Correspondingauthor:LIYu-hua,E-mail:liyuhua hotmail.com
【Abstract】ObjectiveToinvestigategeneticstabilityofattenuatedJapaneseencephalitisvirusSA14-14-
2.MethodsThenucleotidesequencesofEproteinofmasterseedvirus,workingseedvirusandvaccinestrainof
Japaneseencephalitisvirus(JEV)SA14-14-2weredeterminedandcomparedwiththoseofJEVattenuatedstrainin
additiontovirulentstrainSA14.ResultsNucleotideacidandaminoacidsequencesofEproteinofthoseJEVs
areidentical.AminoacidsequencecomparisonofthoseJEVswithSA14-14-2indicatethatthereisonlyoneamino
aciddifferentatE447.ConclusionJEVattenuatedstrainSA14-14-2isgeneticallystableandsafe.
【Keywords】Japaneseencephalitisvaccine;VaccinestrainSA14-14-2;Geneticstability;Eprotein
作者单位:成都生物制品研究所(李玉华,李海玲,吴永林,陈宣
洪,黄玉仙);中国药品生物制品检定所(俞永新);日本国东京都神经
科学综合研究所(保井孝太郎)
通讯作者:李玉华,610063成都生物制品研究所(E-mail:liyuhua
@hotmail.com)
流行性乙型脑炎病毒是引起人类严重疾病的
黄病毒属中的一个成员,该病是亚洲病毒性脑炎的
主要病因.在流行地区,临床疾病年发病率为10/10
万～100/10万,病死率平均为30%,临床症状较重的
存活者伴有永久性神经,精神病后遗症〔1〕.最近几
年,在以前没有乙脑流行的地区如澳大利亚也有了
乙脑病毒感染的报道〔2〕,预防和控制该病尤为重要.
目前,世界范围内,有3种疫苗存在:鼠脑纯化疫
苗〔3〕,地鼠肾细胞灭活疫苗,地鼠肾细胞活疫苗〔4〕.
鼠脑纯化疫苗获得了世界范围内使用的许可,但是,
该疫苗本身所存在的问题如:可能发生严重的过敏
反应,生产工艺复杂,价格昂贵〔3〕,有必要开发更安
全,有效,价廉的乙脑疫苗.
原代地鼠肾细胞活疫苗经过10多年约2亿儿
童使用后,临床结果显示该疫苗有安全,免疫原性
好,副反应小等优点〔5〕.在中国和世界上的部分国
家,乙脑活疫苗对控制流行性乙型脑炎的流行正起
着很好的作用〔6,7〕.同时,乙脑病毒活疫苗主种子和
生产疫苗用的原代地鼠肾细胞经过英国安全实验室
(Q-oneBiolab)检定,结果表明乙脑活疫苗病毒主种
子和原代地鼠肾细胞无与地鼠,啮齿类动物,人,牛,
猪有关的外源病毒污染〔5〕.现在,世界卫生组织已
将原代地鼠肾细胞活疫苗免疫作为控制和预防乙型
脑炎的重要手段,推广使用乙脑活疫苗,研究乙脑活
疫苗病毒SA14-14-2基因稳定性,从分子水平论证乙
脑活疫苗的安全性是大家关注的焦点,有重要意义.
材料和方法
病毒:流行性乙型脑炎活疫苗病毒主种子SA14-
14-2(JEV-MVS5)为乙脑活疫苗原始种子在原代地鼠
肾细胞培养的第5代病毒;流行性乙型脑炎活疫苗
病毒工作种子SA14-14-2PHK6(JEV-WS6)为主种子
在原代地鼠肾细胞培养的第6代病毒.流行性乙型
858 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
脑炎活疫苗病毒SA14-14-2PHK7(JEV-V)是工作种
子在原代地鼠肾细胞培养的第7代病毒,批号为
20011085.
RNA抽提:采用德国Mannheim公司HighPure
ViralRNAKit,以说明书的方法提取病毒RNA.
cDNA合成和PCR扩增:根据基因库中登录的
流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2核苷酸序列
设计本实验所需引物,由TaKaRa公司合成.上游引
物(5''-GTCAACGCGTGGTATTTACC-3''),下游引物(5''-
TCCACCCAGGCTTCCACGTC-3'').用InvitrogenTMlife
Technologies公司SUPERSCRIPTTMFirst-StrandSynthesis
SystemforRT-PCR试剂合成第一条cDNA,即于0.2ml
管中,依次加入以下各液并充分混匀:10×RTbuffer
2 l,25mmol/LMgCl
2
4 l,10mmol/LdNTP1 l,引物
2 l,DTT2 l,RNasin1 l,RNA7 l,SuperscriptⅡ1 l,
42℃1h.加入RNaseH,37℃15min,95℃5min.
PCR扩增采用TaKaRa公司的TaKaRaRNALAPCRTM
Kit,依次加入10×LAbuffer10 l,25mmol/LMgCl
2
10 l,2.5mmol/LdNTP16 l,上,下游引物各1 l,cD-
NA0.5ml,Taq-p1 l.94℃2min,94℃30s,55℃30
s,72℃30s,30个循环.72℃延伸5min.
PCR产物的纯化:采用Omega公司的E.Z.A○R
Cycle-pureKit,按说明书方法回收纯化目的片段.
核苷酸序列分析:采用双脱氧链终止法.由
TaKaRa公司利用ABIPRISMBigDyeTMTerminatorCycle
SequencingReadyReaction试剂盒和ABIPRISMTM377XL
DNA序列分析仪测定核苷酸序列.
结果
1.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子和乙脑活
疫苗病毒E蛋白由1500个核苷酸组成,编码500个
氨基酸(见图1).
2.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子与活疫苗
病毒及基因库中登录的JEV(AF315119)E蛋白核苷
酸比较:图2显示乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子
及活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列完全相同,与
乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(AF315119)E蛋白核苷
酸序列比较,E1340位点上核苷酸不同(G→A),同
源性为99.9%.
3.乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及活疫苗
病毒和基因库中JEV(AF315119)E蛋白上氨基酸比
较:图3表明编码乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子
和疫苗病毒的E蛋白氨基酸序列完全相同,与基因
库中乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(AF315119)E蛋白氨
图1乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子和乙脑活疫苗
病毒E蛋白核苷酸组成
Fig1.NucleotidesequenceencodingEproteinofmaster
seed,workingseedanditscorrespondingvaccineofJEVlive-at-
tenuatedvaccine
958 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
图2乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子与活疫苗病毒
及基因库中登录的JEV(AF315119)E蛋白核苷酸比较
Fig2.NucleotidecomparisonofEproteingeneofJEV
masterseed,workingseedandvaccineviruswiththesequence
ofJEVSA14-14-2intheGenBank(AF315119)
基酸序列相比,E447位点氨基酸发生了改变(G→
D),同源性为99.8%.
4.乙脑病毒活疫苗株(SA14-14-2)与其亲代强
毒株SA14基因中编码E蛋白的关键氨基酸比较:根
据文献报道,乙脑病毒减毒株SA14-14-2与其亲代强
毒株SA14的E蛋白基因中存在9个氨基酸差异,其
中E138,E176,E315,E439位点氨基酸在乙脑病毒强
毒株SA14减毒过程中起最重要作用〔8,9〕.本研究中
SA14-14-2主种子,工作种子和活疫苗病毒与乙脑强
毒株比较均发生了9个氨基酸的变异,毒种与疫苗
间无差异,结果见表1.讨论
E蛋白是乙脑病毒的重要抗原,含有与病毒毒
力密切相关的决定性氨基酸〔10,11〕,能诱导产生中和
抗体〔12-14〕.已有研究表明,黄病毒属病毒强弱毒株
间如黄热病毒Asibi/17D〔15〕,乙型脑炎病毒SA14/
SA14-14-2〔16〕,AT31/at222〔17〕E蛋白基因的关键氨基
图3乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及活疫苗病毒
和基因库中JEV(AF315119)E蛋白上氨基酸比较
Fig3.ComparisonofaminoacidofEproteinofmaster
seedvirus,workingseedvirusanditscorrespondingvaccine
withthatofJEVSA14-14-2fromGenBank
表1乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子,疫苗,基因库
中乙脑病毒弱毒株与乙脑病毒强毒株SA14E蛋白基因中氨
基酸比较
Table1.ComparisonofaminoaciddifferenceinEprotein
ofJEVSA14-14-2masterseedvirus,workingseedvirusand
vaccineviruswiththatofJEattenuatedstrain(AF315119)in
GenBankanditsvirulentstrainSA14
ntΔaa▲
Master
seedvirus
Working
seedvirus
Vaccine
virus
SA14-14-2PHK7
AF315119*
SA14#
1296E-107FFFPhe(F)Leu(L)
1389E-138KKKLys(K)Glu(E)
1503E-176VVVVal(V)Ile(I)
1506E-177AAAAla(A)Thr(T)
1769E-264HHHHis(H)Gln(Q)
1813E-279MMMMet(M)Lys(K)
1921E-315VVVVal(V)Ala(A)
1977E-334PPPPro(P)Ser(S)
2293E-439RRRArg(R)Lys(K)
ΔIndicatednucleotide;▲indicatedaminoacid;*indicatestheaminoacidsof
SA14-14-2inGenBankpublicatedbyZengmingetal;#referstotheaminoacidsofJEV
virulentstrainSA14inGenBankanalyzedbyAihara
酸的变化与乙脑病毒毒力改变或者强毒株毒力减弱
密切相关.因此,分析乙脑病毒活疫苗减毒株E蛋
068 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
白的分子生物学特性对研究乙脑活疫苗病毒基因稳
定性有重要意义.
乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及其疫苗病
毒的E蛋白由1500个核苷酸组成,编码500个氨基
酸,与以往报道的乙脑病毒其它毒株E蛋白核苷酸
序列一致〔16-20〕.主种子,工作种子及其疫苗病毒的
E蛋白基因核苷酸及氨基酸序列完全一致,表明从
主种子代,工作种子代至疫苗时,基因是稳定的.
与乙脑病毒弱毒株SA14-14-2核苷酸序列比较,
虽然与基因库AF315119比较在E蛋白第1340位点
核苷酸及相应的E447位点氨基酸有不同,但是,与
基因库中另一乙脑病毒弱毒株SA14-14-2(D90915)〔8〕
及范行良〔21〕等报道的乙脑病毒弱毒株SA14-14-2的
核苷酸序列则完全一致.个别核苷酸的改变可能与
操作过程有关.另外,乙脑病毒E蛋白基因中和减
毒有关的氨基酸是E138,E176,E315,E439〔22〕.本研
究显示,在乙脑病毒活疫苗主种子,工作种子及其疫
苗病毒的E蛋白基因中,这些氨基酸均未发生改变,
与乙脑病毒弱毒株的序列(AF315119,D90915)一致.
与乙脑强毒株SA14比较,本研究的乙脑活疫苗病
毒,工作种子和主种子E蛋白基因关键氨基酸与乙
脑病毒其它强毒株间氨基酸有一致性的差异(表1),
表明SA14-14-2株乙脑活疫苗在生产过程中的基因
稳定性,乙脑活疫苗对小鼠脑内毒力十分稳定与其
基因稳定性密切相关〔23〕.从分子水平证明了用该
毒株制备活疫苗的安全性.
参考文献
1KuraneI,TakasakiT.Immunogenicityandprotectiveefficacyofthecur-
rentinactivatedJapaneseencephalitisvaccineagainstdifferentJapanese
encephalitisvirusstrains.Vaccine,2000,18(Supplement2):33-35.
2MackenzieJS.TheecologyofJapaneseencephalitisvirusintheAustralian
region.ClinVirol,1999,27:1-7.
3TsaiTF.NewinitiativesofthecontrolofJapaneseencephalitisbyvaccina-
tion:MinutesofaWHO/CVImeeting,Bangkok,13-15October1998.
Vaccine,2000,18(Supplement2):1-25.
4YuYX,ZhangGM,GaoYP,etal.SafetyofaliveattenuatedJapanese
encephalitisvirusvaccine(SA14-14-2)forchildren.AmericanJournalof
TropicalMedicineandHygiene,1988,39:214-217.
5YuYX,ShinSH.Progressinqualitycontrolandproductionofliveatten-
uatedvaccineinChina.MeetingoftheWHOsteeringcommitteeon
DENGUE/JEvaccines.Geneva9-10April2002.
6ZhouBL,JiaLL,XuXL,etal.Alarge-scalestudyonthesafetyand
epidemiologicalefficacyofJapaneseencephalitis(JE)livevaccine(SA14-
14-2)intheJEendemicareas.ChinJEpidemiol,1999,20(1):38-41.
7BistaMB,BanerjeeMK,ShinSH,etal.Efficacyofsingle-doseSA14-
14-2vaccineagainstJapaneseencephalitis:Acasecontrolstudy.The
Lancet,2001,358(8):791-795.
8AiharaS,RaoC,YuYX,etal.Identificationofmutationsthatoccurred
onthegenomeofJapaneseencephalitisvirusduringtheattenuationpro-
cess.VirusGenes,1991,5:95-109.
9曾明,俞永新,董关木,等.乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株
SA14-14-2基因组全序列的测定.中华微生物学和免疫学杂志,
2001,21(5):535-539.
10NiH,ChangGJ,XieH,etal.Molecularbasisofattenuationofneu-
rovirulenceofwild-typeJapaneseencephalitisvirusstrainSA14.JGen
Virol,1995,76:409-413.
11SumiyoshiH,TignorGH,ShopeRE.Characterizationofahighlyattenu-
atedJapaneseencephalitisvirusgeneratedfrommolecularlyclonedcDNA.
JInfectDis,1995,171(4):1144-1151.
12Kimura-kuradaJ.YasuiK.AntigeniccomparisonofenvelopeproteinE
betweenJapaneseencephalitisvirusandsomeotherflavivirusesusingmon-
oclonalantibodies.JGenVirol,1986,67:2663-2672.
13Kimura-kuradaJ,YasuiK.ProtectionofmiceagainstJapaneseen-
cephalitisvirusbypassiveadministrationwithmonoclonalantibodies.J
Immunol,1988,141:3606-3610.
14YasudaA,Kimura-kuradaJ,OgimotoM,etal.Inductionofprotective
immunityinanimalvaccinatedwithrecombinantvacciniavirusesthatex-
pressprMandEglycoproteinofJapaneseencephalitisvirus.JVirol,
1990,64:2788-2795.
15HahnCS,DalrympleJM,StraussJH,etal.Comparisonofthevirulent
AsibistrainofYellowfeverviruswiththe17Dvaccinederivedfromit.
ProcNatlAcadSciUSA,1987,84:2019-2023.
16NitayaphanS,GrantJA,ChangGJ,etal.Nucleotidesequenceofthe
virulentSA14strainofJapaneseencephalitisvirusanditsattenuatedvac-
cinederivative,SA14-14-2.Virology,1990,177:541-552.
17LiYH,WakitaT,YasuiK.Genomeregionresponsibleforthepathogeni-
sisofJapaneseencephalitisvirus.4thJapan-Chinavirologycongressheld
inKunming,China28-29July2002.
18SumiyoshiH,MoriC,FukeI,etal.Completenucleotidesequenceof
theJapaneseencephalitisvirusgenomeRNA.Virology,1987,161:497-
510.
19MarlouN,MangadaT,TakagamiT.Molecularcharacterizationofthe
JapaneseencephalitisvirusrepresentativeimmunotypestrainJaGAr01.
VirusResearch,1999,59:101-112.
20HashimotoH,NomotoA,WatebabeK,etal.Molecularcloningand
completenucleotidesequenceofthegenomeofJapaneseencephalitisvirus
Beijing-1strain.VirusGenes,1988,1:305-317.
21范行良,俞永新,李德富,等.乙型脑炎病毒野毒株及其不同减
毒株E蛋白基因序列比较.中国病毒学,2002,17(3):216-220.
22WaltonEM,ShopeRE,BlankFl.Studyofneurovirulencelocusof
Japaneseencephalitisvirus.ⅩⅣthInternationalCongressforTropical
MedicineandMalaria.1994,p124.
23俞永新.流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2减毒株的表型和
基因型特性及其稳定性.中国计划免疫,2002,8(5):283-287.
(收稿日期:2003-04-04)
168 中华微生物学和免疫学杂志2003年11月第23卷第11期ChinJMicrobiolImmunol,November2003,Vol23,No.11
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