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传染性软疣病毒!"#$%基因腺病毒重组粘粒构建! 论著
传染性软疣病毒!"#$%基因腺病毒重组粘粒构建!
孙星慧,吴军,易绍萱,罗高兴,陈希炜,贺伟峰
(第三军医大学西南医院烧伤研究所重庆$&&&''%)
摘要:目的构建传染性软疣病毒(!"()!"#$%基因腺病毒重组粘粒.方法从软疣小体中提取病毒)*+,经,"-
扩增后构建于./"#0克隆载体上.对克隆产物测序后,与粘粒.+1"+23定向重组.结果克隆出!"#$%基因并构建了.+14
"+234!"#$%粘粒重组体.结论本方法建立为研究!"#$%基因转染对趋化因子的拮抗作用奠定基础.
关键词:趋化因子;传染性软疣病毒;,"-
中图分类号:-''056##文献标识码:+文章编号:#78#4%''$%(5&&5)&%4&79$4&''
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传染性软疣病毒(B;KK@>,!"()属
于痘病毒家族,基因组含#0&&&&个C.,其中的!"#$%基因
含''#9个C.,可编码产生一种含#&$个氨基酸的!"#$%-蛋
白.!"#$%-是趋化因子类似物,只能和趋化因子受体结合
而不能激活受体,是趋化因子的天然拮抗剂[#].
本研究用,"-方法从!"(病毒基因组中扩增和克隆
!"#$%基因,并在此基础上构建成!"#$%基因腺病毒载体
重组粘粒(.+1"+234!"#$%),为研究其基因转染后的免疫抑
制作用打下基础.
材料与方法
@ 材料病毒)*+提取试剂盒:上海生工公司;质粒小
量提取试剂盒:上海华舜公司;末端钝化试剂盒,腺病毒载
体重组粘粒试剂盒,)*+连接试剂盒:日本:EPE-E公司;!4
包装试剂盒,粘粒提取试剂盒:美国,IE BE<DE公司;重组质
粒克隆,"-筛选试剂盒:华美公司;凝胶纯化试剂盒:美国
-;3聚
合酶,./"#0质粒等由大连:EPE-E公司提供.
@A方法
@A@ 病毒)*+的扩增从经皮肤科确诊的传染性软疣
患者身上刮取软疣小体,用病毒)*+提取试剂盒提取病毒
)*+.根据QA=RE=O中!"#$%的序列(/078$0),设计引物序
列如下:,#:9S4J<''''/3;;/3JEJJJ<<EJEJ<<J3<33<4''S,,5:9S4
J<''//33;33<3<<3J<3<<E3JE各&65B!,,#,,5各
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5
Y将总体积加
至9&"K.其中,N ;CA>3聚合酶为高保真性高效聚合酶.在
,V07&&(,A OD=VKBA ,/Z+),"-仪上扩增:0$[预变性#BD=;
0%[#&>,99[''&>,85[''&>,''&个循环.取9"K,"-产物在
#6&\的琼脂糖凝胶上(含&69"JXBK溴化乙锭,以下同)电
泳[5].并同时送:EPE-E公司测序.
@A@A质粒与,"-产物连接分别对,"-产物和./"#0
质粒用V<;-U和REBTU进行双酶切,用凝胶纯化试剂盒回收
目的片段.用:EPE-E公司)*+连接试剂盒连接,反应总体
积#&"K:./"#0#"K,,"-酶切纯化产物#"K,FT
5
Y''"K,Z;K@3D;=U
#9"K.#7[连接过夜.转化感受态]!#&0大肠杆菌,取9&"K
菌液涂布于含7&"JXBK氨苄青霉素,表层涂有$&"K14JEK
(5&=JXBK)和$"KU,:Q(5&&=JXBK)的^R蓝白斑筛选固体培养
基上,''8[孵箱过夜培养[''].挑取白色菌落,加入#&&"K无
菌水中.取9&"K用重组质粒克隆,"-筛选试剂盒进行,"-
扩增筛选.,"-引物与./"#0质粒中KE<_基因中多克隆位
点两侧的序列特异互补.
@B质粒的提取及酶切鉴定将经,"-筛选为阳性克隆
的另9&"K菌液接种到含7&"JXBK氨苄青霉素^R液体培养
基,''8[,5&& XBD=摇菌过夜,用质粒小量提取试剂盒提取质
粒.重组质粒用V<;-#和REBT#内切酶进行双酶切鉴定.
阳性克隆送:EPE-E公司测序.
@C!"#$%腺病毒重组粘粒构建用V,>JJM,*=>),@=@@,@9@M,J>*,)@J);
@ ; !C$''($)*+质粒;=,* ; !C$''($)*+质粒经G/37#
和FA2I#双酶切后的图谱
图* !"#$"%&''($)*+腺病毒重组粘粒正向
重组体的筛选
) ; , @9992AB41B(@999,)999,MJ9,J99,@J9,)99:!);@,=,J,M,均为
目的基因正向插入的!"#$"%&''($)*+腺病毒重组粘粒8$7产物;
*,>,+,为目的基因反向插入或未插入的克隆8$7结果.
%讨论
传染性软疣病毒有($K)和($K@两种类型,是双链
,-"病毒,属于痘病毒家族,基因克隆时不需要进行反转
录[),J].两种类型病毒($)*+基因的同源性达+D<,蛋白
的同源性为+M].我们设计的引物对($K)和($K@的($)*+基因都
能进行扩增,都能满足研究需要.克隆的($)*+基因经测
序证明属于($K@型.并且,我们在引物JO端设计了不同的
酶切识别序列.通过G/37H和FA2IH双酶切,8$7产物与克
隆载体以粘性末端相连接,提高了连接效率和实现了定向
克隆.
在进行8$7时,习惯上使用热稳定性较好的PAQ聚合
酶,但PAQ聚合酶不具有保真性,8$7过程会出现较多碱基
错配,扩增产物与目的,-"的序列不能完全保持一致,不能
用来进行基因的克隆.8RS聚合酶虽然具有保真性,但扩增
效率较低,8$7产物很少,提纯及酶切后不能满足与质粒连
接的需要.在8$7时我们选择了既有高保真性,又具有高
效扩增效率的!TB3:1U&高保真聚合酶.该酶的产物量较多,
即使经@次提纯后也能满足与克隆载体连接的需要.克隆
的($)*+基因经测序证明与L16FA64里报道的完全一样.
在进行重组,-"筛选时,我们将氨苄青霉素抗性筛选,
!"#$基因蓝白斑筛选,%&''筛选和酶切鉴定结合到一起,大
大提高了阳性克隆筛选的准确率.
目前,有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体,和
其他基因载体相比,腺病毒载体具有宿主范围广,感染率
高,理化性质较稳定,遗传毒性较低等优点.其最大的缺点
是重组腺病毒的产生较复杂,且效率不高.因此()*"+,[-]
等用基因组./0末端蛋白质复合物和重组粘连共同转染
123细胞的方法,使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百
倍.
该系统虽具有上述优点,但在实际操作中我们发现,由
于所用的粘粒较大,为44+5,所以在构建重组粘粒的过程
中,无论是连接了目的基因的粘粒转染细菌,还是重组粘粒
中目的基因插入方向鉴定,较通常操作要困难得多.我们
在用连接了目的基因的粘粒转染.67!菌时,使用了./0
包装蛋白,使转染率得到了明显的提高.同样,在鉴定粘粒
载体中是否有目的基因插入及插入方向时,传统的方向是
提取./0后,经限制性内切酶消化鉴定,在本实验中由于重
组体片段较大,直接用酶切粘粒的方法几乎是不可能的,且
酶切操作较繁琐,灵敏度低.%&''方法能大规模筛选插入
阳性克隆,我们在设计引物时,上游引物与载体的启动子区
域特异结合,下游引物与目的基因终止密码子后的区域特
异结合,这样,只有目的片段正向插入才能扩增出条带,反
向插入则无扩增产物.由此,可同时实现重组体结构和插
入方向鉴定,并且可一次鉴定大量的克隆.
趋化因子是一类结构上相似的对白细胞具有定向趋化
募集作用的细胞因子,肽链结构中都含有四个保守性的半
胱氨酸,并分别在其&8端和/6
1
8端含有受体结合部位和受
体激活部位.趋化因子与98蛋白偶联受体结合而介导不同
免疫细胞的趋化作用[:].
(&;4:''蛋白的氨基酸序列与"类趋化因子(&%8;,
()KO!,
;2:=,;:(;):12N
[7]贾文祥N医学微生物学[(]N北京:人民卫生出版社,
1TT;N-:N
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传染性软疣病毒!"#$%基因腺病毒重组粘粒构建!
孙星慧,吴军,易绍萱,罗高兴,陈希炜,贺伟峰
(第三军医大学西南医院烧伤研究所重庆$&&&''%)
摘要:目的构建传染性软疣病毒(!"()!"#$%基因腺病毒重组粘粒.方法从软疣小体中提取病毒)*+,经,"-
扩增后构建于./"#0克隆载体上.对克隆产物测序后,与粘粒.+1"+23定向重组.结果克隆出!"#$%基因并构建了.+14
"+234!"#$%粘粒重组体.结论本方法建立为研究!"#$%基因转染对趋化因子的拮抗作用奠定基础.
关键词:趋化因子;传染性软疣病毒;,"-
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传染性软疣病毒(B;KK@>,!"()属
于痘病毒家族,基因组含#0&&&&个C.,其中的!"#$%基因
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!"#$%基因,并在此基础上构建成!"#$%基因腺病毒载体
重组粘粒(.+1"+234!"#$%),为研究其基因转染后的免疫抑
制作用打下基础.
材料与方法
@ 材料病毒)*+提取试剂盒:上海生工公司;质粒小
量提取试剂盒:上海华舜公司;末端钝化试剂盒,腺病毒载
体重组粘粒试剂盒,)*+连接试剂盒:日本:EPE-E公司;!4
包装试剂盒,粘粒提取试剂盒:美国,IE BE<DE公司;重组质
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@A方法
@A@ 病毒)*+的扩增从经皮肤科确诊的传染性软疣
患者身上刮取软疣小体,用病毒)*+提取试剂盒提取病毒
)*+.根据QA=RE=O中!"#$%的序列(/078$0),设计引物序
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和FA2I#双酶切后的图谱
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目的基因正向插入的!"#$"%&''($)*+腺病毒重组粘粒8$7产物;
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%讨论
传染性软疣病毒有($K)和($K@两种类型,是双链
,-"病毒,属于痘病毒家族,基因克隆时不需要进行反转
录[),J].两种类型病毒($)*+基因的同源性达+D<,蛋白
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能进行扩增,都能满足研究需要.克隆的($)*+基因经测
序证明属于($K@型.并且,我们在引物JO端设计了不同的
酶切识别序列.通过G/37H和FA2IH双酶切,8$7产物与克
隆载体以粘性末端相连接,提高了连接效率和实现了定向
克隆.
在进行8$7时,习惯上使用热稳定性较好的PAQ聚合
酶,但PAQ聚合酶不具有保真性,8$7过程会出现较多碱基
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效率较低,8$7产物很少,提纯及酶切后不能满足与质粒连
接的需要.在8$7时我们选择了既有高保真性,又具有高
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目前,有关基因转染研究最多的载体为腺病毒载体,和
其他基因载体相比,腺病毒载体具有宿主范围广,感染率
高,理化性质较稳定,遗传毒性较低等优点.其最大的缺点
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123细胞的方法,使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百
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在用连接了目的基因的粘粒转染.67!菌时,使用了./0
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组体片段较大,直接用酶切粘粒的方法几乎是不可能的,且
酶切操作较繁琐,灵敏度低.%&''方法能大规模筛选插入
阳性克隆,我们在设计引物时,上游引物与载体的启动子区
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异结合,这样,只有目的片段正向插入才能扩增出条带,反
向插入则无扩增产物.由此,可同时实现重组体结构和插
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趋化因子是一类结构上相似的对白细胞具有定向趋化
募集作用的细胞因子,肽链结构中都含有四个保守性的半
胱氨酸,并分别在其&8端和/6
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8端含有受体结合部位和受
体激活部位.趋化因子与98蛋白偶联受体结合而介导不同
免疫细胞的趋化作用[:].
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[7]贾文祥N医学微生物学[(]N北京:人民卫生出版社,
1TT;N-:N
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·上一篇：儿童肛周传染性软疣!例临床病理特征
