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蛋白质体学
报告
蛋白质体学概观
陈义雄老师
所别: 应用科学与工程研究所
老师: 李永安 教授
学生: 周旻恩
学号: 491598014
目录
壹,摘要 ……………………………………. 3
贰,绪言 ……………………………………. 4
参,蛋白质体(Proteome)及蛋白质体学Proteomics)…………………………….. 5
肆,研究流程 ……………………………….. 7
伍,蛋白质体学之应用………………………10
陆,结论 ……………………………………..18
柒,参考文献 ………………………………..20
壹,摘要
从各种原核生物至真核生物,如微生物,老鼠,人类,染色体序列陆续被解开来後,将成为庞大的基因资料库,藉此相互比对以说明蛋白质所表现之图样,进而推论其蛋白质功能.蛋白质体技术是倚赖质谱仪(mass spectrometry)及二维胶电泳(two-dimentional gel electrophoresis),以提供主要视窗来进入不同蛋白表现情形的分析(8).
所谓蛋白质体学,就是对於蛋白质进行大量分析,以提供後基因时代对基因功能多一些了解.蛋白质体学可以分成三个主要领域:第一,对於蛋白质大量鉴定与转译後修饰进行微量蛋白质特性分析;第二,应用於比对疾病发展过程中不同蛋白质表现之情况;第三,运用mass spectrometry与yeast two-hybrid系统加以研究蛋白质间之作用关系(1).
从蛋白质的相同性与三度空间结构来预测细胞构造蛋白质之成份及其功能,是有其困难性,若是能从蛋白质体方向进行研究,或许能够得到最终的答案;经由分子生物技术不断的改革後,相信在未来几年,蛋白质体学将会加速对蛋白质的生化功能,形成途径与代谢过程之研究而更加了解(1).
贰,绪言
基因体计画 (genome project) 的各项研究已在世界各地陆续展开,目前完成的有酵母 (yeast),大肠杆菌 (E. coli) 等,尚在进行中的有老鼠 (mouse),果蝇
(drosophila),植物 (arabidopsis) 以及人类基因体计画 (human genome project)等. 这些基因结构研究完成,并非代表工作的完成,而是一条全新道路的开展,由於这些基因所表现之功能,才是科学家所要得知的.而基因表现之执行者就是蛋白质,因此对整体蛋白质之研究乃二十一世纪生化学上最主要之课题(3).
美国於六十年代「登月计划」後,由美国能源部及国家卫生研究院主导,展开长达十五年(1990年-2005年)的跨世纪人类基因体计划(Human Genome Project),试图解开生命的奥秘.在许多先进国家及医药,生物科技公司相继加入,注了庞大的财力与人力,人类基因体草图,已於目前完成解读.然而,基因体结构的完成并非代表对人类生命体已经有完整的解答;正如赛雷拉公司(Celera Genomics)总裁Dr. Craig Venter所说:「绘出人类基因体图谱,只是代表生命科学的起点而已.」依分子生物学的中心法则(Central dogma:DNA→RNA→Protein)得知,生命的分子,不论其遗传物质为DNA或RNA,其最终产物均为蛋白质,由此可知,基因体功能的最终目的就是表现蛋白质;基因表现及调控(Gene expression and regulation)的过程,则是为了保障蛋白质能适时,适地并适量的表现.当基因体的研究正如火如荼的展开时,科学家赫然发现,身为万物之灵的人类基因不过约三万多个,与黑猩猩更有99 %的相同,而仅仅1 %基因的不同,却造就人类与黑猩猩之间如此大的差异,当黑猩猩还在地上爬的时候,人类的足迹早已踏上月球(13).
基因表现的差异,并不一定代表其相对蛋白质或相关蛋白质群的功能或表现有所改变,而主要的原因在於上,下游蛋白质相互调节,或蛋白质与基因间彼此的调控.因此,了解蛋白质表现图谱(Expression profile)的变化趋势,有助於疾病成因的探讨,药理药化的研究,癌症医学的应用,检验标记的开发等等.在1995年出现了一个新名词,蛋白质体(Proteome)-基因体上蛋白质表现的统称,凡是经由蛋白质及转译後调节(Post-translational modification)的研究来探讨基因表现的方法皆可称之为蛋白质体分析(Proteomic analysis);由於蛋白质体学的功能强大,因此在短短的几年间即大量应用於基础医学研究.在後基因体时代(Post-genomic era),蛋白质体学(Proteomics)具有高产能(High-throughout),完整性(Global view),又能确认基因产物-蛋白质的表现差异,并进行fmole(10-15 莫耳)之超微量蛋白质鉴定及胺基酸序列分析,已受到大家所重视(4).
参,蛋白质体(Proteome)与蛋白质体学
(Proteomics)
"The analysis of the entire PROTEin complement expression by a genOME." 即说明蛋白质体这个字的由来;蛋白质体指在某组织,器官或细胞内所表现之所有蛋白质总称,蛋白质体的分析研究即称为蛋白质体学(13).
Proteome 这个字是由 genome 衍生来的,故与 genome 有密切关系.Genome 是一个细胞染色体上全体基因的总称,假设这些基因全数表现成蛋白质,此一总体蛋白质即称为 proteome. 当各物种的 genome 一一被解出之後,我们可以翻出其总体蛋白质,由其所含的蛋白质种类,即可推测该细胞的代谢生理,或者其生理病变.要记得一个细胞内的总体基因,并不是每一个基因都正在表现,因此一个细胞的 genome 会因表现时期差异而有许多不同的 proteomes. 由於 genome 及 proteome 都是庞大的资料库,如何应用电脑以及分析软体,已成为一专门学科 bioinformatics,日益重要.
基因定序的工作目前几乎已经完全自动化,人体的全部基因在 2000 年中期应该可以完全解出来,而水稻的染色体序列,已经被 Monsanto 秘密完成,即将完全公开;对於基因序列的使用,美国与英国已经呼吁应该由人类所共享.因此,我们应可跳过基因定序的浩大工程,直接开始思考『後基因时期』的新型态研究工作 . 台湾是个小国,电脑科技已有相当的基础,虽然软体科技上并不十分成熟,但已经是我们最大的经济筹码;如何利用已知的基因序列,加上电脑科技,去找出一条可行的途径,提升台湾在生物科技界的竞争力,则是我们能否在 21 世纪存活的关键.
将来的生物科技,在蛋白质的研究上,会越来越重要,在某些方面可能更甚於对核酸的重视.为了因应此一趋势,未来必须著重在蛋白质科技方面的教学与研究,由蛋白质的纯化开始,一直到最後的修改与量产,成为纯化 →分析 →功能 →构造→改良→量产的完整系列,才能开创蛋白质之相关产业(12).
基因体学和蛋白质体学研究的主要差异为何 所谓的基因体学,其实也可以说是「讨论储存在DNA中所有遗传资讯」的总称.基因在经过一连串的作用後产生蛋白质,以成为生物体的结构或是具有调控作用的工具,也因此使得不同的生物体间具有不同的特性.而蛋白质体学主要是在讨论蛋白质的氨基酸排列顺序以及蛋白质的立体结构;因为蛋白质的氨基酸排列是由基因所决定,因此基因体学和蛋白质体学之间有著相互的关连性.
然而在浩瀚的生命科学领域中事情往往并不是如此的单纯,事实上是蛋白质存在著三度空间的结构排列,科学家们并无法单独藉由氨基酸的排列顺序就可以推测出蛋白质的真正结构,因此蛋白质体学主要是利用已知或是理论的蛋白质结构资料,进一步去分析和推测未知的蛋白质结构.一般来说,蛋白质体学的研究囊括了结构生物学 (Structure Biology),蛋白质表现(Protein Expression),蛋白质交互作用 (Protein Interactions),高速蛋白质体图谱(High-Throughput Proteomic Mapping),蛋白质改造(Post-translation Modification)和细胞膜蛋白质(Membrane Proteins)等各项专业而相当重要的领域.科学家们日以继夜的努力研究目的就是希望能一窥蛋白质的真面目(12).
肆,研究流程
过去蛋白质体学分析之主要内容,就是分别将不同生物的器官,组织,细胞…等的蛋白质利用二维电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)将蛋白质一一分开,然後分析其蛋白质种类,结构资讯,经由电脑软体分析比对,将资料传送到著名的SWISS-PROT及PIR-International(Protein Information Resource)…等资料库中心进行比对.随著基因体资料大增,电脑分析处理能力的进步及生物资讯学的发展,蛋白质体学研究才得以成为二十一世纪生命科学研究的新显学(13).
蛋白质检体制备(Sample preparation)
譬如器官,组织,细胞,血清或微生物...等,只要有蛋白质的成分存在,皆可用来分析;由於蛋白质可执行许多生物功能,因此具有多样且复杂的物理化学特性;也由於检体形式及检体来源差异极大,因此在进行分析前的检体处理上便极为重要.
首先我们将器官或组织打碎,将细胞打破,加入适当的试剂(例如8 M urea,4 % CHAPS及DTE...等等),取得欲分析的蛋白质检体(5).
二维电泳分析(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)
二维电泳分析(2-DE)可以说是蛋白质体分析的主要技术(core technology),整个二维电泳分析过程.
首先将欲分析的蛋白检体以等电点聚焦电泳(Isoelectic focusing , IEF)将蛋白质依等电点(pI)进行第一维分离,续将此分离结果使用SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis)依蛋白质分子量进行第二维分离;由於经过两种原理分离蛋白质分子,因此能够分析非常微量的蛋白质.
其实二维电泳分析(2-DE)并非新兴技术,早在七十年代中期就已经发展出这套电泳分析系统;然而碍於电泳结果再线性不佳,且无法进一步深入分析,因此迟迟未能普及.直到固定式pH梯度胶片(Immobilized pH-gradient strip,IPG)及High Voltage programmed IEF machine的出现,提升解析度及技术上的实用性,才得以大量应用在研究上(7).
2.1 第一维:等电点聚焦电泳(Isoelectic focusing, IEF)
蛋白质依本身胺基酸的组成不同,而带有不同电荷数,亦即有不同的等电点,当外在pH值等於蛋白质本身的pI值时,就达到等电点,此时净电荷为零,蛋白质即固定不动.等电点聚焦电泳(IEF)就是使用一种带有不同酸碱值(pH梯度)的胶条,依照等电点的不同将蛋白质分离.
以往IEF电泳之困难点在於必须自行铸胶,而目前已有商卖改良之「固定式pH梯度胶片(IPG)」,配合厂商开发之电脑化高电压(8,000至10,000 volts, Max)之IEF电泳系统,第一维电泳部分才得以突破.
第二维:SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis)
将作用完毕之IEF置入SDS-PAGE胶片上方,利用SDS-PAGE胶片基质(Matrix)中的分子筛(Molecular sieve),将IEF胶条上已初步分离之蛋白质再依分子量(M.W)大小不同而分开(7).
电泳胶片染色及影像扫描(Computer scanning)
执行电泳後的SDS-PAGE胶片以适当的染料(如Silver stain,Coomassie brilliant blue或Ruby stain)染色,放入高解析度的扫描器中获得影像.SDS-PAGE胶片也可以转印(Blotting)至Nitrocellulose或PVDF膜上,以免疫化学方法侦测出特定的蛋白质.
影像分析(Image analysis)
经由高效能影像扫描,再以电脑软体分析,可以侦测出蛋白点;也可以与正常或已知的蛋白质模组对照,分析彼此的差异点,选出有意义的标的蛋白质(Target protein)进行探讨.
蛋白质点切割(Spots excision)
藉由仪器以机械手臂将欲探讨或有意义的标的蛋白质点切割下来,将此蛋白质点进行蛋白质鉴定及胺基酸序列分析.
蛋白质鉴定(Protein identification)
6-1 质谱仪分析(Mass spectrometry)
蛋白质鉴定以Edman degradation(一种由蛋白质N端至C端方向切割,逐一解出蛋白质胺基酸序列的方法.)为基础,来定出蛋白质的胺基酸组成份.一般可以定出10至40个胺基酸序列.近年来发展出高效能的质谱仪技术(MALDI-ToF-MS及Q-ToF-MS-MS)能够精准解析出蛋白质的分子量,序列,推断出胺基酸片段上的修饰,例如磷酸化,醣化…等等.
资料库比对(Database Comparison-bioinformatics)
经由质谱仪分析的蛋白质与蛋白质资料库进行比对,得知此标的蛋白质的种类,或有可能是新的未知蛋白,再由此蛋白质进行学理上的探讨或应用(13).
伍,蛋白质体学之应用
随著各项基因体计画完成,所有的资讯也会储存於资料库当中;这些不同基因体之表现型 (phenotype) 之比较,将会是一个新的里程碑.过去之研究都是从型态上观察各个组织细胞间的差异,进而找出不同的基因;在未来则是利用完成定序之各基因体,进而研究其表现於细胞的功能,因此 proteome(蛋白质体)分析也成为蛋白质研究重要课题之一.
蛋白质体研究以高解析度,高效能的二维电泳(2-DE),影像分析,质谱仪(MS)结合生物资讯学来分析,定量及鉴定蛋白质.由蛋白质的分析结果我们可以了解蛋白质在细胞内不同位置的表现,调节,活性,功能及交互作用;经由比较各细胞不同发育期之间蛋白质表现的差异性,我们可以探讨生物的代谢途径及致病机转,找出疾病的病变蛋白质,研发新的诊断标记或进行新药开发…等等(6).以下分别说明蛋白质体研究的应用:
诊断标记(Diagnostic markers)及肿瘤标记(Tumor markers)
1-1感染性疾病
将基因体或是由所取得的检体利用蛋白质体技术将其展现出来,可以对此生物功能获得较全面性资讯.当人类得到某种感染性疾病时,利用被感染者的血液或病变细胞当作检体,以蛋白质体方法分析与控制组间之差异性蛋白,筛选感染性微生物之标的蛋白质,利用这些标的蛋白质探讨其感染及代谢途径或是制造出诊断性抗体,相信这将成为研究感染性疾病的新标准模式.
台湾在1998年爆发肠病毒大流行,严重威胁台湾民众的健康及生命安全,即使到今日,肠病毒感染仍是令人闻之色变.根据调查研究,在台湾肠病毒引起的手口足病(HMFD, Hand-mouth-foot disease)及中枢神经病变,以肠病毒71型(Enterovirus 71)的比例最高;虽然可以利用取病人的血液或脑脊髓液以分子生物学(例如RT-PCR)的方法诊断,也有相关的肠病毒基因晶片来侦测肠病毒;但若能以蛋白质体技术探讨病毒在感染过程中表现之标的蛋白质,并利用此标的蛋白质发展预後诊断试剂组(Prognostic kit),建立抗肠病毒71型的药物筛选模式,相信更有助於肠病毒的治疗,诊断及疫情监控.
体液性疾病
蛋白质体可以用来分析体液中的特殊蛋白质,蛋白质体学可以用来分析体液中特殊的蛋白,来解说在疾病诊断上之影响,有助於对疾病成因之了解,病程之控制与研判预後之结果.在一些患有脑膜炎,头部外伤,急性呼吸窘迫,肾功能不足,溶血性贫血或痴呆症病史的病人,这些病史都和体液中总体蛋白质的研究有关,将可用来发展一些较快速简易的诊断方法.患有脑膜炎或是头部外伤的患者,可以取其脊髓液,透过双向电泳技术来鉴定蛋白质型态,尤其是脊髓液中的血清输铁蛋白的後修饰作用.患有呼吸窘迫的病人,因其胸腔充满液体而压迫到气管,可经由胸腔穿刺吸出该液体後便可减轻患者的症状,再利用双向电泳技术分析体液的成分.但是目前对患有淋巴瘤病人身上的溶血性贫血症则难以侦测出来,因为其免疫球蛋白的轻链相当地少;而患有家族性淀粉样变性的病人,也很难诊断得出肾功能不足,因其许多的单株 IgA 的重链被水解之故,这些都可以透过双向电泳技术来分析检验之.目前对患有快速痴呆症者,可以在其脊髓液中,检验发现两种不正常的蛋白 (命名为 130 和 131),最近被确定为 Tau g chain,此为临床上 CJD 所特有的病徵.由此更可知蛋白质体学在新的疾病指标或疾病模式的发现上,所扮演的重要角色.
蛋白质体学的研究也可以帮助我们去寻找新的疾病指标,相信在不久的将来,甚至可在脊髓液或血液中侦测出 prion 蛋白质.整体性的测量脊髓液中所缺乏的正常脑部蛋白,将有助於监测疾病的进程,更进一步有助於疾病的治疗(11).
心血管疾病
扩大性心肌病变(Dilated cardiomyopathy, DCM )是一种严重的心脏疾病,也是现代繁忙的都市人经常罹患的疾病,最後将导致心脏失去功能;病人通常都只能期待换心以维持生命.运用蛋白质体的方法已经鉴定出心肌中150种蛋白质,比较後发现有25个蛋白质有明显的差异;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人(或高危险群)的蛋白质做比对,或许可以在疾病产生初期达到早期预防的目的.
癌症医学研究方面
根据卫生署公布的资料,癌症已经连续多年高居国人十大死因的首位,平均每17.5分钟就有一个家庭因为癌症而面临死别的伤痛.由过去的研究资料显示,超过50％的癌症与p53的变异有关(p53是一种抑癌蛋白质),蛋白质体分析方法能够分辨出蛋白质分子结构上轻微的变化;经由p53的蛋白质体学研究,更可以釐清p53异常所造成细胞的调节缺陷及凋亡(Apoptosis)的机转.
虽然目前在临床上已经发展出许多肿瘤标记,例如CEA,CA125….等可供利用,但是碍於专一性及准确度不高,并无法十分精确的应用在癌症的诊断上,大多数都用来做为癌症治疗及预後的指标;蛋白质体方法进行肿瘤研究可能可以发现新的肿瘤标记并建立肿瘤或癌症的2D资料库.
1-4-1 乳癌 (breast cancer)
在比较人类正常乳房组织与恶性乳房癌的蛋白质分布中,发现两者之间有专一性的蛋白质差异存在.在肿瘤细胞中,至少有 22 种蛋白质会不正常的增加,一种蛋白质则会减少.另外也发现到某些特定的蛋白质的表现与 estrogen 与 progesterone 接受器之间有相关连性.
1-4-2 肺癌 (lung cancer)
肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一.临床上肺癌的诊断往往已属晚期.直至目前为止,并无有效的治疗方案可得.所以任何有助於肺癌诊断或预後的发展都是有助於肺癌的治疗方针的.也因此,有许多的科学家是致力於以双向电泳技术研究人类肺癌的.在分析组织病理学上不同种类 (histopathological types) 的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞体会有不同的蛋白质表现图谱.另外,也发现有一专一性的蛋白质仅会出现在原发性肺腺癌 (primary lung adenocarcinomas)上.例用此技术将可有效地鉴定出新的肿瘤标志 (tumor marker),在鉴别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益.
1-4-3 结肠癌 (colon cancer)
结肠癌是一种常见的癌症.虽然临床有 Dukes 氏分类与分级法,但对於癌症的发展程度和预後却仍难评估.为了寻找新的结肠癌抗原或标志 (marker).利用双向电泳与免疫转渍技术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分离出的一系列蛋白质.并将有意义之蛋白质点 (spot) 切割出,进行蛋白质序列分析以鉴定这些蛋白质.曾有研究针对人类结肠性疾病,使用单株抗体分析结肠 heat shock protein 表现的情形,结果发现 hsp 70 酸性的 isoforms 在结肠息肉 (polypous) 与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论是在量上或质上均有相当的差异;此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或 Crohn's 肠炎组织中则有不同的 hsp 70 碱性 isoform 被发现.
1-4-4 肾脏癌 (kidney cancer)
人类的肾脏癌是较少见的癌症,其中源自於近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌 (renal cell carcinoma) 大约占成人恶性肿瘤的 3 %.但如同许多实质性肿瘤般,肾细胞癌发现时期均属癌症末期,外科手术已难治愈的阶段.并且无适当的肿瘤标志可参考.在研究肾脏癌组织的研究中发现有四种蛋白质的表现在肾癌细胞中会消失.其中有两种蛋白质分别为 ubiquinol cytochrome c reductase, mitochondrial NADH-ubiquinone oxido-reductase complex I.这暗示粒线体功能的缺失在肾细胞癌的发生上扮演种要的角色.虽然该研究没有发现特定的标志蛋白质.但尚有许多可能与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鉴定.
1-4-5 转移的潜力与癌症的治疗 (metastatic potential and cancer treatment)
直至目前为止,评估肿瘤细胞是否具有转移的潜力仍是不容易.但肿瘤细胞转移与否对於治疗方针的选择与预後是相当重要的.因此转移潜力的评估是研究的新方向之一. Schwalke 等人曾利用双向电泳的策略分析具有转移潜力的胰脏细胞癌细胞株的蛋白质表现.同样的,Osada 等人也以双向电泳的技术研究 E-cadherin 在肝细胞癌 (HCC) 中的肝内转移性上所扮演的角色为何.至於癌症治疗的发展上,Weinstein 等人曾建立了以 information-intensive approach 作为癌症的分子药理学研究基础.主要针对 60 种人类的细胞株,分别处理 60,000 种以上的化合物,目的在筛选出能有效抑制细胞株生长的分子.接著应用双向电泳分析观察各种细胞株对各种化合物处理後的蛋白质表现图谱.目前约 60 种细胞株的双向电泳资料库已被建立.这不但有助於了解药理分子对细胞内蛋白质体的整个变化,也将提供癌症治疗新方针的依据之一.
1-5 免疫性蛋白质 (immunogenic protein)
自整个基因体或是组织中所抽取的粗萃取物,利用蛋白质体学技术将其展现出来,可以对生物现象获得一全面性的资讯.最佳的例子便是免疫系统辨认出感染性疾病中的标的蛋白质.当人得到感染性疾病时,利用其血清来筛选感染性微生物之蛋白质,进而找到主要的致病性蛋白质.利用这些蛋白质可以制造出强有力的疫苗,相信这将成为研究感染性疾病的标准方法.这些相关的资讯可以利用双向电泳图谱来分析.另一个相关的领域是在过敏疾病的研究,尤以之花粉的免疫性研究已较清楚,并可对过敏病人进行减敏治疗.此外如医学上普遍使用的乳胶手套所造成的过敏,研究者可以直接地萃取出重要的致敏性蛋白质,研究其功能与结构并进一步藉由分生技术探讨其过敏机制.作者研究室目前则致力於黴菌及海鲜类致敏性蛋白质之研究,希望未来能发展出控制过敏疾病之新药物.
1-6 体液中的醣蛋白
在疾病发生时,常伴随有醣蛋白的修饰作用发生,如癌症,发炎反应,酒精中毒等等.双向胶体电泳可供分析体液或血液中的醣蛋白之一些微异质性 (microheterogenecity),在最近的研究中,由醣蛋白图谱鉴定出一些新的醣蛋白,包括 Apo J, clusterin, SP-40 等四十个蛋白.同时,结合双向电泳和 lectin affinity blotting 的技术也可以让我们来了解正常人的血浆/血液中醣蛋白的特殊组成或变化,例如分析胎儿和婴幼儿的血浆/血清蛋白图谱,并和成人的图谱比较,则至少有十个不同处被鉴定出来.
在许多疾病中醣蛋白图谱的变化是一极具再现性及非常容易操作的方法,例如研究 CDG (carbohydrate-deficient glycoprotein) syndrome 发现所有N-link 醣蛋白多出了一些高 pI 值的 isoform,此外研究 CDG syndrome 病人血清醣蛋白及其在肝中前驱物发现缺乏 Apo J 和血清 amyloid P 蛋白.这血清醣蛋白图谱显示不正常的 isoforms,例如质量下降,并且朝向阴极移动.此外,研究风湿性动脉炎,心肌梗塞,癌症病人及健康自愿者的血清中之 a1 酸性蛋白的微异质性.经由双向电泳的分析发现,所有样品之 a1 酸性醣蛋白的电荷有明显的差异且在癌症病人中有较高的表现量.
生化毒理及药理学研究方面
许多生化分子藉著讯息传导(Signal transduction),经由蛋白质的调节作用,例如磷酸化,去磷酸化,甲基化....等,引发一连串的生化反应;某些药物在人体内的传送及代谢也是藉著与蛋白质(例如Albumin)结合来进行;这些代谢机转及作用模式都非常适合使用蛋白质体学来研究及探讨.将某一特定细胞株经药物处理後,比较此细胞的蛋白质体在加药前後的变化,探讨此药物的作用及代谢模式,有助於新药的开发(11).
Weinstein等人针对六十种人类细胞株以60,000种以上的化合物处理,筛选出抑制细胞株生长的分子,并以蛋白质体研究方法观察各个细胞株在以各种化合物处理後的蛋白质表现图谱,建立2D资料库,这除了有助於了解药物对细胞内蛋白质体的变化外,也提供癌症治疗的方向.
2-1 磷酸化作用 (phosphorylation)
在许多的生化反应中,讯息的传递是藉由胜汰 (peptide) 的磷酸化或去磷酸化.某些药物的药理功能或是某些毒性物质的致毒性即来自於其可调节或改变这些磷酸化或去磷酸化.
药理学和毒理学中,有些研究利用双向电泳去分析蛋白质磷酸化或去磷酸化,例如 cytokines 与 receptors 的相互作用,其间的讯息传递包括了数个磷酸化蛋白质.Bistratene A 可改变人类血癌细胞中蛋白质磷酸化的模式.许多荷尔蒙可启动细胞中磷酸化或去磷酸化的讯息传递.在绒毛膜组织中,绒毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin) 的形成包括了蛋白质的磷酸化.
药物代谢物和运送 (drug adduct and vehicles)
药物或药物的代谢物,如磷酸根或醣基,可与蛋白质共价结合,改变其一级,二级和三级结构.为了研究这些效应,必须去鉴定其被修饰过的胜汰.利用蛋白质体分析是一个很好的研究工具,例如 acetaminophen 为一种普遍使用的止痛药和退热药,其大量使用时会危害肝脏且可能致命,但其m-hydroxy isomer不会危害肝脏,两者皆可被肝的 cytochromes p450 氧化,与肝的蛋白质共价结合,因此可利用双向电泳方法研究比较两者的差异.
药物在血液中运输常常是与蛋白素 (albumin) 或醣蛋白结合.某些药物可与之共价结合,因此药物被吸收利用的量会减少许多,例如 penicillin 会修饰血清中的蛋白素.为了增强药物的投递和改善其运送,必须有药物携带者 (drug carriers),如胶状携带者或微小粒子 (nanoparticles).利用蛋白质体的方法可有效的追踪和鉴定血液蛋白质与这些人工合成粒子间的交互作用.例如利用双向电泳分析表面以 latex 修饰过的粒子其在血液中被蛋白质吸收的模式.有些 apolipoprotein 在 reticulo-endothelial 系统吸收这些粒子中扮演重要角色,实验证明这些 apolipoprotein 确实可吸附於微小粒子表面.
2-3 荷尔蒙 (hormones)
产科学和妇科学中,有些荷尔蒙可用於避孕和不孕上.科学家利用蛋白质体的方法研究荷尔蒙处理後整体蛋白质的表现情形.高量的 ethinyl estradiol-norgestrel 可用於紧急避孕法,其可有效抑制子宫内黄体酮连结子宫内膜蛋白质 (progesterone-associated endometrial proteins),改变子宫内膜的环境使之不合适於早期胚胎的生存.
在农业生物技术方面
由於基因工程技术的发展,高经济价值的农产品及基因食品大量的被制造及推广,提升农业的价值及产能,有助於解决粮食危机.然而,经由遗传工程制造出的农产品(或食品)经食用後对人体是否会造成伤害,在人体内是否会产生不良的反应仍有许多值得探讨及釐清之处;藉由农业蛋白质体学的研究可以深入的探讨复杂的生物农业问题,追踪基因转殖品的後续变化,评估对人体及环境生态上所造成的影响.
4. 其它方面
4-1 追踪复杂 (tracking complexity)
蛋白质体学分析法可用来研究寄主-病原菌或寄主-寄生物之间的作用关系.豆科植物与根瘤菌共生而形成根瘤,以进行固氮作用.不同菌株具有不同的固氮能力,所以利用蛋白质体学技术可以了解何种分子对於固氮作用是最重要的.另外,可由有无形成根瘤之植物,而找出形成根瘤的相关蛋白质.於澳洲国立大学得研究显示,在亚麻感染的模式中发现,具致病性的的真菌其蛋白质有不同的表现情形.因此,藉由蛋白质体学之研究可以深入地了解复杂的生物性课题.
4-2 提升农业产品 (improved agricultural products)
传统农业是一门经验性的科学,即使在基因运作的规则尚未被了解之前,在植物或是动物的育种方面就已经有高度建构的成就.於过去的数十年间,在基因转殖技术的引导下,以使得农业进入了生物技术的革命性时期.以生物工程的技术增加植物对病原及寄生虫,如病毒,细菌,真菌或是昆虫的抵抗力就是一个很好的例子.相对於 mRNA 的大量表现,大多数的抵抗机制都涉及毒性蛋白或是保护性蛋白的表现.这些蛋白质的表现对於该保护作用而言是必须的,如马铃薯的抗病性.但如果没有即时地运用蛋白质体学技术来辅助新的毒性蛋白的发现,或是用来确认植物对於病原可能的抵抗性,也就是在基因转形的早期阶段大量地表现相关的蛋白质,则目前的成就真是一件令人惊讶的事.以现在许多农产品为例,其高附加价值的本质特性在分子层次上仍未被了解,而这样的表现型可能是起因於多种蛋白质表现的结果,而非单一基因产物所造成的.以木材为例,其外貌如色泽,纤维强度等都是重要的经济性特质,可以藉由树木蛋白质体学技术来确认影响这些特质的相关蛋白质,甚至可以更进一步地发展种子育种或是以分子生物学的方法来改良这些产品.
4-3 增加农产品价值 (value added agricultural products)
随著能产品市场的国际化以及产能上的压力,必须对於农产品的处理程序做一个全盘性的回顾.从前看来低价值的副产品,在今日全部被重新评估是否具有发展成新产品的潜力.而已有的产品也同样地再审视是否有更佳的处理程序.目前三种最迫切的农业便是酪农业,屠宰业与谷物.这三类产品在生产的过程中都会产生数以吨计的低价值性副产品,而这些副产品一般不是丢弃就是花钱请其他单位代为处理.详细地分析这些副产品的蛋白质成分与利用生物科技来增加其利用价值似乎有点令人惊讶,但这确实是有其必要的!
在酪农业中主要的蛋白质副产品来自於乳酪制造商.目前利用蛋白质体学技术发现在乳酪中有生长因子的存在,有可能成为具有促进生长的重组蛋白质的产品,或是应用在发展促进伤口愈合的制剂,如各式的溃疡药剂.而这些新的利用价值,甚至可能改变整个乳酪制造业的经济型态.
屠宰业在传统上会收集动物的血,骨头以及内脏来做为肥料.但是血清中含有超过两千种以上的蛋白质,其中已知生理功能的却仅有数百种而已!因此利用蛋白质体学技术的研究将可能导致许多新高价值蛋白的发现,而赋予肉品业的副产品有更高的价值.
食品业一直相当重视加工食品,而此类食品的制造需要有温和不刺激的蛋白质来源.一般最常使用的是牛奶中的酪蛋白,但是原料价格高.如果能直接利用谷类来抽取,那将是一个相当可观的市场.不过在这之前,应该先彻底的研究谷类蛋白质的特质,才能合理地发展这方面的应用.目前正研究积极方向的便是双向电泳技术应用於谷类粗抽蛋白质的分析(11).
陆,结论
基因体的研究,将使人类生物密码及表现讯息依序排列出来,如同将英文字母依顺序排在一本大字典裏,但是这个是静态且为潜在 (potential) 讯息,这些基因有的生物功能仍然需积极了解.生物医学的研究,在 post-genomics 仍有走不完的路.基因体资料好比给我们一个地图,实际的风景,要亲临现场才能了解.我们在病毒学研究历史上已充分突显这个限制.比如 B 型肝炎病毒基因体在二十年前已完全解出,只含四个基因,但二十年後,仍有许多 B 型肝炎的问题未解.人类基因体有十万个基因,将要多少年去了解 因此生物医学研究者不需惶恐,要冷静思考,如何利用基因体资料加速生物医学的发现.
对医学研究者而言,眼前是一个黄金时代,人类所以产生疾病,有一部分是基因体有天然的变异 (natural variation 或 diversity),这可看做广义的生物多型性或多样性 (polymorphism).而这种特异点遗传疾病,特别清楚,多半是某一个或几个基因发生的变异,导致表现型异常.所以如果能针对遗传相关的疾病家族,加以分析,决定与基因体那一片断或区间有密切的连锁关系,我们就可以利用基因体字典,寻找该区间有的基因,而快速的缩小搜寻范围,帮忙找到致病基因,这是目前盛行的定位选殖 (positional cloning) 策略.
在生物医学界,如生物学是观察生物体的歧异性;人类学则是观察,记录人类表现型之差异.而医学是看人类生理,病理表现型的差异,理论上只要累积足够的案例,就可以进行与相关基因的连锁分析 (linkage analysis),而帮忙找出目标基因.这种分析,在单基因或性联基因的遗传疾病上,特别有成果.因此基因体研核心研究室,将建立 泛基因体的连锁分析 技术.与临床医师合作,如果有良好的临床案例以及遗传家族,就可以加以分析,快速的解决问题.
研究基因的动态(Dynamic)表现,唯有从蛋白质著手,由各物种基因体我们可以推出其蛋白质体的组成,由所含有的蛋白质种类及含量,可以推断出该生物的生理,代谢情形及病变.然而每一个基因并不是随时都在表现的,因此一个细胞在不同发育或生理时期会有不同的蛋白质体.蛋白质的表现可以是疾病的「原因」,也可以是疾病的「结果」.
蛋白质体学分析技术具有高产能,广泛运用的优点,由於电脑资讯科技的蓬勃发展,强大的运算处理能力使的研究实验结果可以储存在资料库中并有效率的进行分析比对,应用到相关的领域中.蛋白质体研究在後基因体时代(Post-genome era)具有强大的功能,蛋白质有复杂且多样的化学特性,可执行种种的生物功能,在不同表现时期有不同的蛋白质体;要以二维电泳及质谱仪技术来进行蛋白质体全面性的分析,还需克服部分难题;例如(1)二维电泳对於微量蛋白质的解析能力,(2)简化检体的制备过程,(3)能否在最适当的时间点取得欲探讨的蛋白质的检体,(4)实验上的再现性能否再提高,(5)数据分析处理的能力.这些都需要不同领域的合作才能够釐清蛋白质的功能表现.
藉由蛋白质体学的研究找出疾病的病变蛋白质:由於大部分的人类疾病几乎都可以在基因上找到根源,因此若能够标出造成病变基因的位置,也就能够找出造成病变的蛋白质(marker protein).在清楚了解病变蛋白质後,就有可能推出该疾病的致病机制,进而可以发展出该疾病的检测方法,甚至是治疗方法.这是在临床医学上的应用(9).
除此之外,我们还可以藉由蛋白质体学的研究来推测出目标生物的代谢途径:检查一个生物体蛋白质体内的所有蛋白质,进而试著拼凑出其细胞的代谢途径.例如当我们发现某病原菌的蛋白质体中有hexokinase(此为糖类代谢中所需的一种酵素),以及其它所有的glycolysis(糖类分解)的酵素,就可以推断此病原菌具有糖解作用,甚至有其下游的糖类代谢作用等.如此便可以了解该病原菌的整体代谢,并找出其弱点加以攻击.
有关检验医学发展的特点,在於将医学相关的生命科学技术或检验之相关成果很快地转化为检验医学项目而应用於临床诊断上;蛋白质体分析除了能够探讨生命现象及疾病的发生外,对於检验医学的最大贡献在於经由比较不同个体间的蛋白质体,找出具有临床意义或与疾病相关的蛋白质,进而发展出相关的的检验试剂及项目,或是与生物晶片结合,制作成蛋白质晶片,运用於临床检验及医护点(point of care)上,这些都是指日可待的(13).
柒,参考资料
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Blackstock WP, Weir MP (1999) Proteomics: quantitative and physical mapping of
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Lopez, M. F. et al (1999) J. Chromatography 722: 191-223.
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9. Wilkins M. R. et al (1997) Proteome research 187-231.
10. 生医报导:追求卓越计画 - 基因体研究核心实验室的策略
11. 生医报导:蛋白质体学於生物医学上之应用
12. 蛋白质当家. 科学人杂志 4 (2002): 46-54.
13. 中华民国医检会报. 2001. Vol .16. No.5
67705
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