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抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立台湾兽...抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立台湾兽医志
导致肿瘤多重药物抗药性(
)的主要机制之一为肿瘤细胞膜上大量
表现转运蛋白(
),包括醣蛋白(
),
()和
()等,其中最早也最被广泛研究的抗药性
转运蛋白为,其分子量为,由抗药性
基因产生,可将许多不同种类的化疗药物排
出肿瘤细胞外,而使药物在细胞内的浓度降低,无
法达到杀肿瘤细胞的药理作用.临床报告指出,
罹患癌症的病人,肿瘤有表现的病人比没有
表现的病人对化疗的反应较差,至於其它抗药
性转运蛋白如,,近几年也开始有一
些研究报告,但在临床癌症方面的重要性,则尚未
有确切的定论.
有鉴於是造成肿瘤抗药性的主因之一,
开发能抑制或干扰其功能的调节药物(
)受到相当的重视,为了探讨,开发
调节药物及更深入研究肿瘤的特性,不
同种类之过度表现之抗药性肿瘤细胞株纷纷
建立,如人类之乳癌细胞株,表皮样癌(
),骨髓癌(),小细胞肺
癌(),肝癌(
)肿瘤细胞等.小鼠的
肿瘤细胞亦大量表现,由相似於人类
抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立
1林庆龄 郭馥华2廖美秀2许维伦2沈立汉1詹东荣
1国立台湾大学兽医学系暨研究所 台北市
2行政院原子能委员会核能研究所同位素应用组 桃园县
(收稿日期:96年9月5日.接受日期:96年10月9日)
摘要
3
林庆龄 等
基因的和基因产生,如小鼠的
乳腺癌(),白血癌(
)细胞株.用於诱导抗药性细胞株之化疗药
物则包含有,,,
等,但以最常用,诱导方式
最初将细胞培养於低浓度药物下,待其适应后增加
药物浓度,以渐进式的方式使细胞产生抗药性,约
需一至二年时间诱导至具有稳定抗药性的细胞株,
且抗药性细胞需持续维持在最终诱导浓度之化疗药
物环境下生长.
虽然抗药性肿瘤之细胞模式可用於筛选
调节药物及探讨抗药性之机制,但距离临床试验仍
有ㄧ大差距,以动物模式进行临床前之安全性和有
效性试验能提供临床试验之参考.以往被认为具潜
力的第一代至第三代调节药物,在临床试验
初期皆因性过高而无法进一步应用於临床.而在
另一方面,许多天然物成份具有抑制功能或
干扰其基因表现的作用,如黄酮类物质(
),中药姜黄成份,大麻生物碱
()等,其中部分物质广泛存在
於植物中,且经常被食用,因此普遍认知其安全性
较之化学合成物相对较佳,然而目前这些天然物质
调节活性的研究主要为离体()实验
模式,活体动物实验的研究报告非常稀少.
常见的抗药性肿瘤动物模式采用免疫缺陷小
鼠,皮下接种抗药性细胞株如人类之乳癌细胞株,
表皮样癌,小细胞肺癌及大肠癌细胞株等
,接种细胞数量依不同来源细胞株而不
同,利用各种技术如,免疫组织化学染色
等确定抗药性肿瘤抗药性基因之,蛋白表
现和功能高於非抗药性肿瘤,亦可观察抗药性和非
抗药性活体肿瘤对化疗药物的反应.此外,亦
有以原位移植野生型人肝癌细胞株於裸鼠
肝被膜下,肿瘤长出后给予化疗药物,并分析
表现及功能以确定建立之抗药性肿瘤动物模式
.学者等人则以建立之抗药性人肝
癌细胞株,接种於小鼠皮下,周后牺牲取下肿
瘤细胞,分析抗药性基因之,蛋白及功能,
也确定建立此抗药性肿瘤之活体模式.上述之
模式皆采用免疫缺陷的小鼠模式,截至目前为止,
同基源()的抗药性肿瘤动物模式报告
稀少,为筛选抗药性调节药物,进行临床前之动物
试验,探讨药物之有效性和安全性,本研究目的为
建立具有抗药性的肿瘤细胞株及其同基源之小鼠肿
瘤动物模式,以应用於抗药性肿瘤之研究.
细胞株及动物模式品系的小鼠大肠癌
细胞株(以下简称)购自
(
),培养於
()培养基(含有
,,
,,和
经℃不活化补体的胎牛血清),温度℃,
的培养箱,间隔天继代次,继代细胞浓
度约×,培养在培养皿.
周龄的雄性小鼠购自国家实验动
物中心或台大医学院实验动物中心,老鼠购入后随
机分笼或分组,一笼只,老鼠饲料(
)及饮水皆定时补充及更
换,室温控制在℃,自动化定时交替日夜周
期(小时),小鼠於适应环境两周后使用於
实验.
建立抗药性细胞株之流程起初由低浓度
的(;购自於公司)加入
细胞开始诱导其抗药性,此株细胞每次
继代时皆加入新鲜的培养基及,浓度逐
渐增高,维持细胞培养於各阶段浓度约
周,最终浓度增加到,此亚型细胞命名为
,同时间持续继代不含药物培
养的细胞株作为对照组.
以测定化疗药物对细胞之杀作用
(×)和
(×)细胞以及重新培养在无
环境七天后之(×)细
胞株(简称细胞株)各取
培养在孔盘,细胞贴附后,加入不同浓度的化
疗药物,培养小时后观察细胞的存活情形,收
细胞之前小时以比例之溶液,
加入细胞使最终浓度为,培养小
时后除去上清液,加入的(
及)将细胞打
破,於暗室存放,隔日以(
)测定
的吸光值并以为背景吸光值.另一方面,
使用已知能抑制的物质,观察其能
否经由抑制的功能而加强化疗药物对细胞株
的杀作用,细胞在加入化疗药物分钟前先加
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3
FL1-H
林庆龄 等
开始抗药性的诱导,大部份细胞
可耐过此浓度的而稳定生长,之后渐次增加
浓度至,最后终於成功诱导具抗药性的
细胞,为期约年.
计算对,和
细胞之细胞存活率的,
对相较於细胞之影
响仍相似,其相近,分别为和,
皆显著高於的,和
的抵抗倍率()达倍以上.
前人研究指出以诱导细胞抗药性,其对
抵抗倍率,在小鼠之乳腺癌(
)为倍,在年学
者等人所使用的为倍,且通
常在抗药性细胞株回到没有化疗药物培养或后
还能维持ㄧ样程度之抗药性.本研究的结
果得到抵抗倍率和文献报告相似,显
示成功的以诱导出抗药性细
胞,且细胞培养在无环境下
天后亦仍然有相似程度之抗药性.已知为
,和的基质,为了厘清
细胞与何基因之过度表现有关,又抗
药性肿瘤细胞对於许多药物应当具交叉抵抗性,因
此,我们选用几种化疗药物包含,
,及,其中
,为之基质,为
及之基质,则非,
及之基质,以实验分析这些化疗药物
对细胞之杀能力后并算出细胞存活率之,结
果显示细胞对,
相较於有很高之抵抗性,相反的,
和对和
细胞之则相似,由此结果推测细
胞之抗药性极可能与相关,而与抗药性传输
蛋白和无关.
进一步分析,和
细胞之表现,结果也显示
大量表现,亦明
显表现,相较於有极显著之上升.
利用分析和
之功能,亦可见细胞之
萤光强度相较於显著较低,又
细胞利用分析下,细胞之
的萤光强度仍然显著低於细胞,细
胞给予已知的抑制药物后,可见
和细胞之萤
光强度相近於细胞,由这些结果可知抗
药性细胞功能显著高於
,但亦可发现细胞在给予
后萤光强度亦有轻微增高,显示
细胞本身有一定程度之活性.
综合以上实验结果,本研究已成功建立抗药性
大肠癌的细胞模式,且此抗药性与
有关.虽然已经有学者建立与相关之抗
药性大肠癌细胞株如人类之,
细胞,然而,若要以人类之细胞植入小鼠以建
立实验动物模式则必须要选用免疫缺陷的小鼠,而
这类小鼠如裸鼠和鼠,因免疫力不足或缺失
而易受病菌所感染,照料上比一般小鼠困难,相反
地,正常小鼠则无免疫缺陷问题,可植入同
基源的皮下不会有免疫排斥作用,且易於
饲养.小鼠与人类之基因相似且基因
产物之正常组织分布亦相似,因此建立此大
肠癌细胞株除了可进一步建立抗药性
肿瘤的同基源动物模式以应用於临床前试验之外,
建立此抗药性细胞株也有利於更深入研究导致
之机制或筛选有效的或
.学者在年发表的文章使用抗药性
之和细胞,其研究结果著
眼在抗药性肿瘤植入到小鼠后对免疫系统的影响
,此类研究显然无法采用免疫缺陷鼠的动物模
式,除了此项研究以外,至今并无和
相关之其他报告.由於癌症占十大死因
之首,肿瘤之问题不容忽视,建立抗药性之
细胞将有助於之动物实验研
究.
文献报告指出不同肿瘤动物模式接种於活体的
细胞数量不尽相同,从××细胞数接
种於活体皆可成功长出肿瘤.本论文所使用
的活体肿瘤化疗时机系参考等学者的研究报
告,利用抗药性与非抗药性表皮样癌肿瘤生长至
时给予化疗疗程,可见到抗药性肿瘤
持续生长,而非抗药性肿瘤的生长则明显被抑制
.另有研究报告建立抗药性原位肝癌肿
瘤的动物模式,将肿瘤细胞植入肝被膜下,约
天后肿瘤大小为公分,始给予
化疗药物诱导其抗药性.参考这些研究报告,
本研究将小鼠分二群分别接种和
细胞於小鼠后肢大腿皮下,接种数量皆为
×个,最佳接种条件为第一群老鼠接种
细胞天后另一群老鼠接种细
胞,接种细胞天后和
抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立
肿瘤大小可达,此时实施
化疗,化疗剂量参考学者於
年,该研究使用二次,间隔天,
化疗肿瘤相较於对照组明显被抑制,但停止化疗约
天后,其则开始继续生长.本
论文为了区分相较於肿瘤
之差异,因此以相同剂量但给予三剂延长观察肿瘤
之间的生长差异.结果显示对照组之二群肿瘤大小
无明显差异,但给药组则可见肿瘤完全
被抑制几乎到消退,而则始终持续往
上生长,因此可知活体肿瘤的确有抗
药性.由给药后肿瘤生长差异,可证实本研究已成
功建立抗药性肿瘤的实验动物模式.
此模式为皮下接种,比原位肝癌和抗药性骨肉
瘤接种骨内之抗药性模式更易观察小鼠肿瘤之生
长与测量.
本研究成功建立的抗药性肿瘤细胞及其的实验
动物模式,未来可进一步於活体动物模式探讨天然
物质如,等天然物成分对肿瘤
表现或功能之影响,并对其药理活性和安全
性进行临床前试验,作为未来临床研究之参考依
据.
本研究承蒙核能研究所辐射应用中心提供部分
经费支持及研究生林庆龄和郭馥华之奖助,特此致
谢.
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抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立
Establishment of A Multidrug Resistant(MDR)Colon Carcin-
oma Cell Line and MDR Tumor Model in BALB/c Mice
11222
1
1
2
ABSTRACT
50
3
nd
()
391778
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导致肿瘤多重药物抗药性(
)的主要机制之一为肿瘤细胞膜上大量
表现转运蛋白(
),包括醣蛋白(
),
()和
()等,其中最早也最被广泛研究的抗药性
转运蛋白为,其分子量为,由抗药性
基因产生,可将许多不同种类的化疗药物排
出肿瘤细胞外,而使药物在细胞内的浓度降低,无
法达到杀肿瘤细胞的药理作用.临床报告指出,
罹患癌症的病人,肿瘤有表现的病人比没有
表现的病人对化疗的反应较差,至於其它抗药
性转运蛋白如,,近几年也开始有一
些研究报告,但在临床癌症方面的重要性,则尚未
有确切的定论.
有鉴於是造成肿瘤抗药性的主因之一,
开发能抑制或干扰其功能的调节药物(
)受到相当的重视,为了探讨,开发
调节药物及更深入研究肿瘤的特性,不
同种类之过度表现之抗药性肿瘤细胞株纷纷
建立,如人类之乳癌细胞株,表皮样癌(
),骨髓癌(),小细胞肺
癌(),肝癌(
)肿瘤细胞等.小鼠的
肿瘤细胞亦大量表现,由相似於人类
抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立
1林庆龄 郭馥华2廖美秀2许维伦2沈立汉1詹东荣
1国立台湾大学兽医学系暨研究所 台北市
2行政院原子能委员会核能研究所同位素应用组 桃园县
(收稿日期:96年9月5日.接受日期:96年10月9日)
摘要
3
林庆龄 等
基因的和基因产生,如小鼠的
乳腺癌(),白血癌(
)细胞株.用於诱导抗药性细胞株之化疗药
物则包含有,,,
等,但以最常用,诱导方式
最初将细胞培养於低浓度药物下,待其适应后增加
药物浓度,以渐进式的方式使细胞产生抗药性,约
需一至二年时间诱导至具有稳定抗药性的细胞株,
且抗药性细胞需持续维持在最终诱导浓度之化疗药
物环境下生长.
虽然抗药性肿瘤之细胞模式可用於筛选
调节药物及探讨抗药性之机制,但距离临床试验仍
有ㄧ大差距,以动物模式进行临床前之安全性和有
效性试验能提供临床试验之参考.以往被认为具潜
力的第一代至第三代调节药物,在临床试验
初期皆因性过高而无法进一步应用於临床.而在
另一方面,许多天然物成份具有抑制功能或
干扰其基因表现的作用,如黄酮类物质(
),中药姜黄成份,大麻生物碱
()等,其中部分物质广泛存在
於植物中,且经常被食用,因此普遍认知其安全性
较之化学合成物相对较佳,然而目前这些天然物质
调节活性的研究主要为离体()实验
模式,活体动物实验的研究报告非常稀少.
常见的抗药性肿瘤动物模式采用免疫缺陷小
鼠,皮下接种抗药性细胞株如人类之乳癌细胞株,
表皮样癌,小细胞肺癌及大肠癌细胞株等
,接种细胞数量依不同来源细胞株而不
同,利用各种技术如,免疫组织化学染色
等确定抗药性肿瘤抗药性基因之,蛋白表
现和功能高於非抗药性肿瘤,亦可观察抗药性和非
抗药性活体肿瘤对化疗药物的反应.此外,亦
有以原位移植野生型人肝癌细胞株於裸鼠
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模式皆采用免疫缺陷的小鼠模式,截至目前为止,
同基源()的抗药性肿瘤动物模式报告
稀少,为筛选抗药性调节药物,进行临床前之动物
试验,探讨药物之有效性和安全性,本研究目的为
建立具有抗药性的肿瘤细胞株及其同基源之小鼠肿
瘤动物模式,以应用於抗药性肿瘤之研究.
细胞株及动物模式品系的小鼠大肠癌
细胞株(以下简称)购自
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周龄的雄性小鼠购自国家实验动
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养的细胞株作为对照组.
以测定化疗药物对细胞之杀作用
(×)和
(×)细胞以及重新培养在无
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培养在孔盘,细胞贴附后,加入不同浓度的化
疗药物,培养小时后观察细胞的存活情形,收
细胞之前小时以比例之溶液,
加入细胞使最终浓度为,培养小
时后除去上清液,加入的(
及)将细胞打
破,於暗室存放,隔日以(
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使用已知能抑制的物质,观察其能
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FL1-H
林庆龄 等
开始抗药性的诱导,大部份细胞
可耐过此浓度的而稳定生长,之后渐次增加
浓度至,最后终於成功诱导具抗药性的
细胞,为期约年.
计算对,和
细胞之细胞存活率的,
对相较於细胞之影
响仍相似,其相近,分别为和,
皆显著高於的,和
的抵抗倍率()达倍以上.
前人研究指出以诱导细胞抗药性,其对
抵抗倍率,在小鼠之乳腺癌(
)为倍,在年学
者等人所使用的为倍,且通
常在抗药性细胞株回到没有化疗药物培养或后
还能维持ㄧ样程度之抗药性.本研究的结
果得到抵抗倍率和文献报告相似,显
示成功的以诱导出抗药性细
胞,且细胞培养在无环境下
天后亦仍然有相似程度之抗药性.已知为
,和的基质,为了厘清
细胞与何基因之过度表现有关,又抗
药性肿瘤细胞对於许多药物应当具交叉抵抗性,因
此,我们选用几种化疗药物包含,
,及,其中
,为之基质,为
及之基质,则非,
及之基质,以实验分析这些化疗药物
对细胞之杀能力后并算出细胞存活率之,结
果显示细胞对,
相较於有很高之抵抗性,相反的,
和对和
细胞之则相似,由此结果推测细
胞之抗药性极可能与相关,而与抗药性传输
蛋白和无关.
进一步分析,和
细胞之表现,结果也显示
大量表现,亦明
显表现,相较於有极显著之上升.
利用分析和
之功能,亦可见细胞之
萤光强度相较於显著较低,又
细胞利用分析下,细胞之
的萤光强度仍然显著低於细胞,细
胞给予已知的抑制药物后,可见
和细胞之萤
光强度相近於细胞,由这些结果可知抗
药性细胞功能显著高於
,但亦可发现细胞在给予
后萤光强度亦有轻微增高,显示
细胞本身有一定程度之活性.
综合以上实验结果,本研究已成功建立抗药性
大肠癌的细胞模式,且此抗药性与
有关.虽然已经有学者建立与相关之抗
药性大肠癌细胞株如人类之,
细胞,然而,若要以人类之细胞植入小鼠以建
立实验动物模式则必须要选用免疫缺陷的小鼠,而
这类小鼠如裸鼠和鼠,因免疫力不足或缺失
而易受病菌所感染,照料上比一般小鼠困难,相反
地,正常小鼠则无免疫缺陷问题,可植入同
基源的皮下不会有免疫排斥作用,且易於
饲养.小鼠与人类之基因相似且基因
产物之正常组织分布亦相似,因此建立此大
肠癌细胞株除了可进一步建立抗药性
肿瘤的同基源动物模式以应用於临床前试验之外,
建立此抗药性细胞株也有利於更深入研究导致
之机制或筛选有效的或
.学者在年发表的文章使用抗药性
之和细胞,其研究结果著
眼在抗药性肿瘤植入到小鼠后对免疫系统的影响
,此类研究显然无法采用免疫缺陷鼠的动物模
式,除了此项研究以外,至今并无和
相关之其他报告.由於癌症占十大死因
之首,肿瘤之问题不容忽视,建立抗药性之
细胞将有助於之动物实验研
究.
文献报告指出不同肿瘤动物模式接种於活体的
细胞数量不尽相同,从××细胞数接
种於活体皆可成功长出肿瘤.本论文所使用
的活体肿瘤化疗时机系参考等学者的研究报
告,利用抗药性与非抗药性表皮样癌肿瘤生长至
时给予化疗疗程,可见到抗药性肿瘤
持续生长,而非抗药性肿瘤的生长则明显被抑制
.另有研究报告建立抗药性原位肝癌肿
瘤的动物模式,将肿瘤细胞植入肝被膜下,约
天后肿瘤大小为公分,始给予
化疗药物诱导其抗药性.参考这些研究报告,
本研究将小鼠分二群分别接种和
细胞於小鼠后肢大腿皮下,接种数量皆为
×个,最佳接种条件为第一群老鼠接种
细胞天后另一群老鼠接种细
胞,接种细胞天后和
抗药性大肠癌细胞株及其小鼠肿瘤动物模式之建立
肿瘤大小可达,此时实施
化疗,化疗剂量参考学者於
年,该研究使用二次,间隔天,
化疗肿瘤相较於对照组明显被抑制,但停止化疗约
天后,其则开始继续生长.本
论文为了区分相较於肿瘤
之差异,因此以相同剂量但给予三剂延长观察肿瘤
之间的生长差异.结果显示对照组之二群肿瘤大小
无明显差异,但给药组则可见肿瘤完全
被抑制几乎到消退,而则始终持续往
上生长,因此可知活体肿瘤的确有抗
药性.由给药后肿瘤生长差异,可证实本研究已成
功建立抗药性肿瘤的实验动物模式.
此模式为皮下接种,比原位肝癌和抗药性骨肉
瘤接种骨内之抗药性模式更易观察小鼠肿瘤之生
长与测量.
本研究成功建立的抗药性肿瘤细胞及其的实验
动物模式,未来可进一步於活体动物模式探讨天然
物质如,等天然物成分对肿瘤
表现或功能之影响,并对其药理活性和安全
性进行临床前试验,作为未来临床研究之参考依
据.
本研究承蒙核能研究所辐射应用中心提供部分
经费支持及研究生林庆龄和郭馥华之奖助,特此致
谢.
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11222
1
1
2
ABSTRACT
50
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