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双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2mRNA作用的表达
陈娜娜,吴曙光(南方医科大学药学院,广东广州510515)
摘要:目的观察环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对体外培养的肝癌细胞HepG2,Hep3B和正常肝细胞系QSG-7701增殖的
作用以及药物对环氧合酶-2(COX-2)mRNA表达的影响,探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系.方法采用Cell
CountingKit-8(CCK-8)细胞计数法测定药物作用24,48,72h后细胞增殖活性,半定量逆转录聚合酶链反应检测各种
细胞系COX-2mRNA的表达水平以及药物作用对基因表达的影响.结果双氯芬酸在10~200μmol/L浓度依赖性地抑
制HepG2和Hep3B细胞的增殖,50μmol/L作用48h后抑制率分别为40.47%和54.49%,半数抑制浓度分别为70.54
和48.39μmol/L.双氯芬酸对正常肝细胞株QSG-7701的抑制作用较弱,作用48h的半数抑制浓度为189.91μmol/.
HepG2,Hep3B细胞均表达COX-2mRNA,QSG-7701细胞几乎不表达COX-2mRNA.双氯芬酸和化疗药5-氟尿嘧啶
均可增强HepG2和Hep3B细胞COX-2mRNA的表达.结论双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的肝癌细胞HepG2
和Hep3B的增殖,并且诱导COX-2mRNA表达上调,提示COX-2在肝癌细胞增殖中具有重要意义.
关键词:双氯芬酸;肝肿瘤;细胞增殖;环氧合酶-2;逆转录聚合酶链反应
中图分类号:R735.7;R979.5文献标识码:A文章编号:1673-4254(2006)06-0814-04
Diclofenacsuppresseshepatomacellproliferationandpromotescyclooxygenase-2mRNA
expression
CHENNa-na,WUShu-guang
CollegeofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofcyclooxygenaseinhibitordiclofenacontheproliferationand
cyclooxygenase-2(COX-2)mRNAexpressionofculturedhepatocellularcarcinomacelllinesHepG2,Hep3Bandhuman
hepatocellularcelllineQSG-7701.MethodsAfterexposuretodiclofenacatvariousconcentrations(10-200μmol/L)for24,
48and72h,thecellproliferationwasanalyzedbyCellCountingKit-8(CCK-8)assayandmRNAexpressiondeterminedby
semi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR).ResultsDiclofenacexposurefor24,48and72h
significantlyinhibitedHepG2andHep3Bcellproliferationinaconcentration-dependentmanner,withinhibitionrateof
40.47%and54.49%after48hexposureto50μmol/LdiclofenacandIC50of70.54and48.39μmol/L,respectively.Amuch
weakerantiproliferativeeffectonQSG-7701cellswasshown,withIC50of189.91μmol/Lafter48-hourexposureto
diclofenac.RT-PCRdetectedCOX-2mRNAinHepG2andHep3Bcells,buthardlyinQSG-7701cells.Treatmentwith
diclofenacor5-FuresultedinelevatedCOX-2mRNAexpressionbothinHepG2andHep3Bcells.ConclusionsDiclofenac
canspecificallyinhibittheproliferationofCOX-2-expressingHepG2andHep3Bcells,andinduceup-regulationofCOX-2
mRNAexpression,whichindicatestheimportantroleofCOX-2intheproliferationofhepatomacells.
Keywords:diclofenac;liverneoplasms;cellproliferation;cyclooxygenase-2;reversetranscription-polymerasechainreaction
环氧合酶-2(COX-2)是催化前列腺素合成的限
速酶,在大多数的细胞和组织为诱生性表达.正常情
况下,此酶低表达或不表达,而在生长因子,细胞因子
和肿瘤启动子的刺激下大量表达,参与炎症和恶性组
织中前列腺素的合成[1].近年来大量研究证实COX-2
参与多种肿瘤,如肺癌,胃癌,膀胱癌,食道癌,尤其是
结肠癌等的发生,发展以及转移和扩散[2],但目前对
COX-2在肝癌发生中的作用仍存在争议.有研究表
明,在由慢性肝炎发展成肝硬化的非肝癌组织和肝癌
组织都存在COX-2的高表达[3,4],COX-2抑制剂可诱
导肝癌细胞的凋亡[5].但同时有学者指出,环氧合酶
抑制剂仅在超出抑制环氧合酶活性的生理剂量时才
对肿瘤细胞具有抗增殖作用,并且此作用不依赖于
COX-2的表达,即通过非COX-2途径起作用[6,7].本
研究观察非选择性的环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对
体外培养的肝癌细胞HepG2,Hep3B和正常肝细胞
系QSG-7701增殖的作用以及药物对COX-2mRNA
表达的影响,以探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系.
1材料和方法
1.1细胞来源
人肝细胞癌HepG2,Hep3B细胞和人结肠癌
HT-29细胞均购自美国典型培养物中心(ATCC),人
收稿日期:2005-12-09
作者简介:陈娜娜(1972-),女,讲师,在读博士研究生,电话:020-
61648167,E-mail:yxbyjs@fimmu.com
通讯作者:吴曙光(1953-),男,南方医科大学药学院院长,教授,博士
生导师,电话:020-61648530
南方医科大学学报(JSouthMedUniv)2006;26(6)
814
814
图3双氯芬酸处理24,48和72h后对QSG-7701细胞
增殖的影响
Fig.3QSG-7701cellproliferationafterdiclofenac
exposurefor24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
050100150200
2.52.0
1.51.0
0.5
D450
24h
48h
72h
diclofenac(c/μmol L-1)
正常肝细胞QSG-7701购自上海细胞所.
1.2试剂DMEM细胞培养基购自Gibco公司,特级无支
原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司,
胰蛋白酶由Amresco生产,细胞计数试剂CCK-8Kit
购自日本同仁化学研究所.人COX-2引物5'-TTCAA
ATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3',5'-AGATCAT
CTCTGCCTGAGTATCTT-3';人GAPDH引物5'-AC
CACAGTCCATGCCATCAC-3',5'-TCCACCACCCT
GTTGCTGTA-3'由北京赛百盛生物有限公司合成,
PAGE纯化,RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公
司,逆转录和PCR试剂购自宝生物公司(TaKaRaEx
TaqTM).
1.3方法
1.3.1细胞培养和CCK-8法测定细胞增殖活性采用
一种新的细胞活性测定方法—CCK-8法代替经典的
MTT法进行细胞增殖的测定,此法原理与MTT法类
似,使用时可直接在细胞培养液中加入试剂进行测
定,操作更为简单,灵敏度和重现性强于MTT法,目
前已在国际上广为使用[8].人肝细胞癌HepG2,
Hep3B细胞和人正常肝细胞QSG-7701均用添加
10%新生牛血清的DMEM培养,按2000个细胞/孔
的密度接种96孔组织培养板,培养24h;细胞生长融
合度约为30%,每孔加双氯芬酸使终浓度分别为0,
10,25,50,100,200μmol/L,每种浓度6孔,同时设立
PBS阴性对照组和5μg/ml5-Fu阳性对照组;分别于
加药24,48和72h加入体积比为1:10的CCK-8试
剂,孵育2.5h;酶标仪上测定450nm吸光度,参比波
长为630nm.
1.3.2RT-PCR检测COX-2mRNA水平HepG2,
Hep3B细胞按2×105个/孔密度接种6孔板,培养24
h,分别加入双氯芬酸和5-Fu,孵育相应时间后用
Trizol试剂提取细胞总RNA,在紫外分光光度计上进
行定量.逆转录合成cDNA第一链,取1.5μl进行
PCR.扩增条件为95℃2min,94℃30s,55℃30s,
72℃1min,35个循环,72℃延伸5min.PCR产物用
1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统作半定量分
析.以COX-2的PCR产物和内参看家基因GAPDH
的PCR产物灰度积分值的比值(relativevolume,RV)
反映COX-2mRNA的表达水平.实验重复3次.
1.4统计学处理
采用SPSS10.0统计软件行单向方差分析
(One-wayANOVA),两两比较用SNK检验.用Bliss
法计算药物的半数抑制浓度(IC50).
2结果
2.1双氯芬酸对HepG2和Hep3B细胞增殖的抑制作用
双氯芬酸10~200μmol/L作用24,48和72h
后,浓度依赖性抑制人肝癌细胞HepG2和Hep3B的
增殖(图1,2),作用48h后,在10μmol/L时即显现
明显的抗增殖作用,抑制率分别为22.8%和24.1%,
50μmol/L时抑制率为40.47%和54.49%,其半数抑
制浓度分别为70.54和48.39μmol/L.阳性对照药
5-Fu5μg/mL作用48h对HepG2和Hep3B细胞增
殖的抑制率分别为50.97%和62.98%.人正常肝细胞
QSG-7701对双氯芬酸的敏感性远低于HepG2和
Hep3B,在浓度大于50μmol/L时才表现出较为明显
的抑制作用(图3),作用48h的半数抑制浓度为
189.91μmol/L.
图1双氯芬酸处理24,48和72h后对HepG2细胞增殖的影响
Fig.1HepG2cellproliferationafterdiclofenacexposurefor
24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
3.02.5
2.01.5
1.00.5
050100150200
diclofenac(c/μmol L-1)
D450
24h
48h
72h
图2双氯芬酸处理24,48和72h后对Hep3B细胞增殖的影响
Fig.2Hep3Bcellproliferationafterdiclofenacexposurefor
24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
D450
020406080100
2.82.4
2.01.6
1.20.8
diclofenac(c/μmol L-1)
24h
48h
72h
陈娜娜,等.双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2mRNA作用的表达第6期815
图4COX-2mRNA在肝癌细胞和正常肝细胞系中的表达
Fig.4ExpressionofCOX-2mRNAdetectedwithRT-PCR
M:DNAmarker;Lane1:HumancoloncancercelllineHT-29asthe
positivecontrol;Lane2:Hep3B;Lane3:HepG2;Lane4:QSG-7701
1000
GAPDH
COX-2
bp
2000
750500
250100
M1234
图5双氯芬酸和5-Fu对HepG2细胞COX-2mRNA表
达的影响
Fig.5Effectsofdiclofenacand5-Fuontheexpression
ofCOX-2mRNAinHepG2cells
A:Electrophoreticpatterns;M:DNAmarker;Lane1:Control
group;Lane2:50μmol/Ldiclofenac;Lane3:5μg/ml5-Fu;B:
Semi-quantificationofCOX-2mRNAexpression.Dataare
expressedastheratioofVCOX-2/VGAPDH.
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
GAPDH
COX-2
M123
bp
2000
1000
750500
250
100
A
RV(COX-2/GPDH)1.4
1.21.0
0.80.6
0.40.2
0.0
B
5-FuDiclofenacControl
***aa
图6双氯芬酸和5-Fu对Hep3B细胞COX-2mRNA表
达的影响
Fig.6Effectsofdiclofenacand5-Fuontheexpressionof
COX-2mRNAinHep3Bcell
A:Electrophoreticpatterns;M:DNAmarker;Lane1:Control
group;Lane2:50μmol/Ldiclofenac;Lane3:5μg/ml5-Fu;B:
Semi-quantificationofCOX-2mRNAexpression.Dataare
expressedastheratioofVCOX-2/VGAPDH.
*P<0.05,**P<0.01vscontrolAB
M123
bp
2000
1000
750
500250
100
GAPDH
COX-2
****
ControlDiclofenac5-Fu
1.00.8
0.60.4
0.20.0
RV(COX-2/GPDH)
aa
2.2细胞COX-2mRNA表达水平
RT-PCR检测结果显示,人肝癌细胞HepG2,Hep3B
均表达COX-2mRNA,而正常肝细胞QSG-7701
COX-2mRNA表达水平远远弱于前二者(图4).人
结肠癌HT-29细胞为表达COX-2的阳性对照细胞.
2.3双氯芬酸和5-Fu对HepG2和Hep3B细胞
COX-2mRNA表达的影响
50μmol/L双氯芬酸处理HepG2细胞72h后,
COX-2mRNA表达明显上升,与对照相比上调了
36.80%(P<0.01),5μg/ml的5-Fu作用72h后
COX-2mRNA表达上调了27.12%(P<0.05,图5).双
氯芬酸50μmol/L和5-Fu5μg/ml作用Hep3B细胞
72h后,分别使COX-2mRNA表达上调了83.56和
79.09%(P50μmol/L)时对肝癌细胞具有抗
增殖作用[6],并且对不表达COX-2的细胞也有相似
作用,此作用可能依赖于非COX-2途径[7].而本实验
发现对于高表达COX-2的肝癌细胞HepG2和
Hep3B,双氯芬酸在10μmol/L的低浓度时就能明显
地抑制细胞增殖,半数抑制浓度分别为70.54和
48.39μmol/L,而对几乎不表达COX-2的正常肝细胞
QSG-7701作用弱,半数抑制浓度为189.91μmol/L.
上述结果表明双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的
肝癌细胞的增殖,提示COX-2在肝癌细胞的增殖中
发挥重要作用.
实验还发现,双氯芬酸在抑制肝癌细胞增殖的同
时,明显升高COX-2mRNA的表达.这与一些学者
在对结肠癌的研究中得到的结论有所不同.Boolbol
等[10]发现环氧合酶抑制剂苏林酸具有抑制结肠癌小
鼠肿瘤组织COX-2表达的作用,Yao等[11]的研究也
显示,COX-2选择性抑制剂Rofecoxib可抑制结肠癌
组织COX-2的表达,从而起到促进肿瘤凋亡的作用.
上述结果提示,COX-2在肝癌细胞中可能起着与在
结肠癌细胞中不同的调节作用.我们在实验中同时发
现,治疗肝癌常用的化疗药5-Fu亦可明显升高
COX-2mRNA的表达.最近有研究报道,5-Fu通过
AMP活化的蛋白激酶上调COX-2的表达[12].还有研
南方医科大学学报(JSouthMedUniv)第26卷816
(上接804页)
参考文献:
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究显示,化疗药如丝裂霉素或阿霉素引起的细胞
DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达,p53通过
Ras/Raf/MAPK途径促进COX-2的表达[13].那么,在
肝癌细胞中,双氯芬酸是否通过上述途径上调
COX-2的表达值得进一步研究.本研究发现的
COX-2在肝癌细胞中与在其他肿瘤细胞中的不同调
节作用有助于进一步了解COX-2在肝癌细胞增殖过
程中的意义.
参考文献:
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陈娜娜,等.双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2mRNA作用的表达第6期817
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作用以及药物对环氧合酶-2(COX-2)mRNA表达的影响,探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系.方法采用Cell
CountingKit-8(CCK-8)细胞计数法测定药物作用24,48,72h后细胞增殖活性,半定量逆转录聚合酶链反应检测各种
细胞系COX-2mRNA的表达水平以及药物作用对基因表达的影响.结果双氯芬酸在10~200μmol/L浓度依赖性地抑
制HepG2和Hep3B细胞的增殖,50μmol/L作用48h后抑制率分别为40.47%和54.49%,半数抑制浓度分别为70.54
和48.39μmol/L.双氯芬酸对正常肝细胞株QSG-7701的抑制作用较弱,作用48h的半数抑制浓度为189.91μmol/.
HepG2,Hep3B细胞均表达COX-2mRNA,QSG-7701细胞几乎不表达COX-2mRNA.双氯芬酸和化疗药5-氟尿嘧啶
均可增强HepG2和Hep3B细胞COX-2mRNA的表达.结论双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的肝癌细胞HepG2
和Hep3B的增殖,并且诱导COX-2mRNA表达上调,提示COX-2在肝癌细胞增殖中具有重要意义.
关键词:双氯芬酸;肝肿瘤;细胞增殖;环氧合酶-2;逆转录聚合酶链反应
中图分类号:R735.7;R979.5文献标识码:A文章编号:1673-4254(2006)06-0814-04
Diclofenacsuppresseshepatomacellproliferationandpromotescyclooxygenase-2mRNA
expression
CHENNa-na,WUShu-guang
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Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofcyclooxygenaseinhibitordiclofenacontheproliferationand
cyclooxygenase-2(COX-2)mRNAexpressionofculturedhepatocellularcarcinomacelllinesHepG2,Hep3Bandhuman
hepatocellularcelllineQSG-7701.MethodsAfterexposuretodiclofenacatvariousconcentrations(10-200μmol/L)for24,
48and72h,thecellproliferationwasanalyzedbyCellCountingKit-8(CCK-8)assayandmRNAexpressiondeterminedby
semi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR).ResultsDiclofenacexposurefor24,48and72h
significantlyinhibitedHepG2andHep3Bcellproliferationinaconcentration-dependentmanner,withinhibitionrateof
40.47%and54.49%after48hexposureto50μmol/LdiclofenacandIC50of70.54and48.39μmol/L,respectively.Amuch
weakerantiproliferativeeffectonQSG-7701cellswasshown,withIC50of189.91μmol/Lafter48-hourexposureto
diclofenac.RT-PCRdetectedCOX-2mRNAinHepG2andHep3Bcells,buthardlyinQSG-7701cells.Treatmentwith
diclofenacor5-FuresultedinelevatedCOX-2mRNAexpressionbothinHepG2andHep3Bcells.ConclusionsDiclofenac
canspecificallyinhibittheproliferationofCOX-2-expressingHepG2andHep3Bcells,andinduceup-regulationofCOX-2
mRNAexpression,whichindicatestheimportantroleofCOX-2intheproliferationofhepatomacells.
Keywords:diclofenac;liverneoplasms;cellproliferation;cyclooxygenase-2;reversetranscription-polymerasechainreaction
环氧合酶-2(COX-2)是催化前列腺素合成的限
速酶,在大多数的细胞和组织为诱生性表达.正常情
况下,此酶低表达或不表达,而在生长因子,细胞因子
和肿瘤启动子的刺激下大量表达,参与炎症和恶性组
织中前列腺素的合成[1].近年来大量研究证实COX-2
参与多种肿瘤,如肺癌,胃癌,膀胱癌,食道癌,尤其是
结肠癌等的发生,发展以及转移和扩散[2],但目前对
COX-2在肝癌发生中的作用仍存在争议.有研究表
明,在由慢性肝炎发展成肝硬化的非肝癌组织和肝癌
组织都存在COX-2的高表达[3,4],COX-2抑制剂可诱
导肝癌细胞的凋亡[5].但同时有学者指出,环氧合酶
抑制剂仅在超出抑制环氧合酶活性的生理剂量时才
对肿瘤细胞具有抗增殖作用,并且此作用不依赖于
COX-2的表达,即通过非COX-2途径起作用[6,7].本
研究观察非选择性的环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对
体外培养的肝癌细胞HepG2,Hep3B和正常肝细胞
系QSG-7701增殖的作用以及药物对COX-2mRNA
表达的影响,以探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系.
1材料和方法
1.1细胞来源
人肝细胞癌HepG2,Hep3B细胞和人结肠癌
HT-29细胞均购自美国典型培养物中心(ATCC),人
收稿日期:2005-12-09
作者简介:陈娜娜(1972-),女,讲师,在读博士研究生,电话:020-
61648167,E-mail:yxbyjs@fimmu.com
通讯作者:吴曙光(1953-),男,南方医科大学药学院院长,教授,博士
生导师,电话:020-61648530
南方医科大学学报(JSouthMedUniv)2006;26(6)
814
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图3双氯芬酸处理24,48和72h后对QSG-7701细胞
增殖的影响
Fig.3QSG-7701cellproliferationafterdiclofenac
exposurefor24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
050100150200
2.52.0
1.51.0
0.5
D450
24h
48h
72h
diclofenac(c/μmol L-1)
正常肝细胞QSG-7701购自上海细胞所.
1.2试剂DMEM细胞培养基购自Gibco公司,特级无支
原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司,
胰蛋白酶由Amresco生产,细胞计数试剂CCK-8Kit
购自日本同仁化学研究所.人COX-2引物5'-TTCAA
ATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3',5'-AGATCAT
CTCTGCCTGAGTATCTT-3';人GAPDH引物5'-AC
CACAGTCCATGCCATCAC-3',5'-TCCACCACCCT
GTTGCTGTA-3'由北京赛百盛生物有限公司合成,
PAGE纯化,RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公
司,逆转录和PCR试剂购自宝生物公司(TaKaRaEx
TaqTM).
1.3方法
1.3.1细胞培养和CCK-8法测定细胞增殖活性采用
一种新的细胞活性测定方法—CCK-8法代替经典的
MTT法进行细胞增殖的测定,此法原理与MTT法类
似,使用时可直接在细胞培养液中加入试剂进行测
定,操作更为简单,灵敏度和重现性强于MTT法,目
前已在国际上广为使用[8].人肝细胞癌HepG2,
Hep3B细胞和人正常肝细胞QSG-7701均用添加
10%新生牛血清的DMEM培养,按2000个细胞/孔
的密度接种96孔组织培养板,培养24h;细胞生长融
合度约为30%,每孔加双氯芬酸使终浓度分别为0,
10,25,50,100,200μmol/L,每种浓度6孔,同时设立
PBS阴性对照组和5μg/ml5-Fu阳性对照组;分别于
加药24,48和72h加入体积比为1:10的CCK-8试
剂,孵育2.5h;酶标仪上测定450nm吸光度,参比波
长为630nm.
1.3.2RT-PCR检测COX-2mRNA水平HepG2,
Hep3B细胞按2×105个/孔密度接种6孔板,培养24
h,分别加入双氯芬酸和5-Fu,孵育相应时间后用
Trizol试剂提取细胞总RNA,在紫外分光光度计上进
行定量.逆转录合成cDNA第一链,取1.5μl进行
PCR.扩增条件为95℃2min,94℃30s,55℃30s,
72℃1min,35个循环,72℃延伸5min.PCR产物用
1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统作半定量分
析.以COX-2的PCR产物和内参看家基因GAPDH
的PCR产物灰度积分值的比值(relativevolume,RV)
反映COX-2mRNA的表达水平.实验重复3次.
1.4统计学处理
采用SPSS10.0统计软件行单向方差分析
(One-wayANOVA),两两比较用SNK检验.用Bliss
法计算药物的半数抑制浓度(IC50).
2结果
2.1双氯芬酸对HepG2和Hep3B细胞增殖的抑制作用
双氯芬酸10~200μmol/L作用24,48和72h
后,浓度依赖性抑制人肝癌细胞HepG2和Hep3B的
增殖(图1,2),作用48h后,在10μmol/L时即显现
明显的抗增殖作用,抑制率分别为22.8%和24.1%,
50μmol/L时抑制率为40.47%和54.49%,其半数抑
制浓度分别为70.54和48.39μmol/L.阳性对照药
5-Fu5μg/mL作用48h对HepG2和Hep3B细胞增
殖的抑制率分别为50.97%和62.98%.人正常肝细胞
QSG-7701对双氯芬酸的敏感性远低于HepG2和
Hep3B,在浓度大于50μmol/L时才表现出较为明显
的抑制作用(图3),作用48h的半数抑制浓度为
189.91μmol/L.
图1双氯芬酸处理24,48和72h后对HepG2细胞增殖的影响
Fig.1HepG2cellproliferationafterdiclofenacexposurefor
24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
3.02.5
2.01.5
1.00.5
050100150200
diclofenac(c/μmol L-1)
D450
24h
48h
72h
图2双氯芬酸处理24,48和72h后对Hep3B细胞增殖的影响
Fig.2Hep3Bcellproliferationafterdiclofenacexposurefor
24,48and72h
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
D450
020406080100
2.82.4
2.01.6
1.20.8
diclofenac(c/μmol L-1)
24h
48h
72h
陈娜娜,等.双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2mRNA作用的表达第6期815
图4COX-2mRNA在肝癌细胞和正常肝细胞系中的表达
Fig.4ExpressionofCOX-2mRNAdetectedwithRT-PCR
M:DNAmarker;Lane1:HumancoloncancercelllineHT-29asthe
positivecontrol;Lane2:Hep3B;Lane3:HepG2;Lane4:QSG-7701
1000
GAPDH
COX-2
bp
2000
750500
250100
M1234
图5双氯芬酸和5-Fu对HepG2细胞COX-2mRNA表
达的影响
Fig.5Effectsofdiclofenacand5-Fuontheexpression
ofCOX-2mRNAinHepG2cells
A:Electrophoreticpatterns;M:DNAmarker;Lane1:Control
group;Lane2:50μmol/Ldiclofenac;Lane3:5μg/ml5-Fu;B:
Semi-quantificationofCOX-2mRNAexpression.Dataare
expressedastheratioofVCOX-2/VGAPDH.
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
GAPDH
COX-2
M123
bp
2000
1000
750500
250
100
A
RV(COX-2/GPDH)1.4
1.21.0
0.80.6
0.40.2
0.0
B
5-FuDiclofenacControl
***aa
图6双氯芬酸和5-Fu对Hep3B细胞COX-2mRNA表
达的影响
Fig.6Effectsofdiclofenacand5-Fuontheexpressionof
COX-2mRNAinHep3Bcell
A:Electrophoreticpatterns;M:DNAmarker;Lane1:Control
group;Lane2:50μmol/Ldiclofenac;Lane3:5μg/ml5-Fu;B:
Semi-quantificationofCOX-2mRNAexpression.Dataare
expressedastheratioofVCOX-2/VGAPDH.
*P<0.05,**P<0.01vscontrolAB
M123
bp
2000
1000
750
500250
100
GAPDH
COX-2
****
ControlDiclofenac5-Fu
1.00.8
0.60.4
0.20.0
RV(COX-2/GPDH)
aa
2.2细胞COX-2mRNA表达水平
RT-PCR检测结果显示,人肝癌细胞HepG2,Hep3B
均表达COX-2mRNA,而正常肝细胞QSG-7701
COX-2mRNA表达水平远远弱于前二者(图4).人
结肠癌HT-29细胞为表达COX-2的阳性对照细胞.
2.3双氯芬酸和5-Fu对HepG2和Hep3B细胞
COX-2mRNA表达的影响
50μmol/L双氯芬酸处理HepG2细胞72h后,
COX-2mRNA表达明显上升,与对照相比上调了
36.80%(P<0.01),5μg/ml的5-Fu作用72h后
COX-2mRNA表达上调了27.12%(P<0.05,图5).双
氯芬酸50μmol/L和5-Fu5μg/ml作用Hep3B细胞
72h后,分别使COX-2mRNA表达上调了83.56和
79.09%(P50μmol/L)时对肝癌细胞具有抗
增殖作用[6],并且对不表达COX-2的细胞也有相似
作用,此作用可能依赖于非COX-2途径[7].而本实验
发现对于高表达COX-2的肝癌细胞HepG2和
Hep3B,双氯芬酸在10μmol/L的低浓度时就能明显
地抑制细胞增殖,半数抑制浓度分别为70.54和
48.39μmol/L,而对几乎不表达COX-2的正常肝细胞
QSG-7701作用弱,半数抑制浓度为189.91μmol/L.
上述结果表明双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的
肝癌细胞的增殖,提示COX-2在肝癌细胞的增殖中
发挥重要作用.
实验还发现,双氯芬酸在抑制肝癌细胞增殖的同
时,明显升高COX-2mRNA的表达.这与一些学者
在对结肠癌的研究中得到的结论有所不同.Boolbol
等[10]发现环氧合酶抑制剂苏林酸具有抑制结肠癌小
鼠肿瘤组织COX-2表达的作用,Yao等[11]的研究也
显示,COX-2选择性抑制剂Rofecoxib可抑制结肠癌
组织COX-2的表达,从而起到促进肿瘤凋亡的作用.
上述结果提示,COX-2在肝癌细胞中可能起着与在
结肠癌细胞中不同的调节作用.我们在实验中同时发
现,治疗肝癌常用的化疗药5-Fu亦可明显升高
COX-2mRNA的表达.最近有研究报道,5-Fu通过
AMP活化的蛋白激酶上调COX-2的表达[12].还有研
南方医科大学学报(JSouthMedUniv)第26卷816
(上接804页)
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究显示,化疗药如丝裂霉素或阿霉素引起的细胞
DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达,p53通过
Ras/Raf/MAPK途径促进COX-2的表达[13].那么,在
肝癌细胞中,双氯芬酸是否通过上述途径上调
COX-2的表达值得进一步研究.本研究发现的
COX-2在肝癌细胞中与在其他肿瘤细胞中的不同调
节作用有助于进一步了解COX-2在肝癌细胞增殖过
程中的意义.
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陈娜娜,等.双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2mRNA作用的表达第6期817
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