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流行性乙型脑炎减毒活疫苗!"流行性乙型脑炎减毒活疫苗!"
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%#$%&''基因的稳定性
范行良,俞永新,李德富,姚智慧
(中国药品生物制品检定所,北京!"""#")
摘要:分别对$%
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上连传至!-代时,发现(个氨基酸突变(.''//!,.''/0,),但不是回复突变.虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内
传!代后发生.''!"-个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工
作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检
测手段.
关键词:流行性乙型脑炎;不同传代株;.基因序列;基因稳定性
中图分类号:1/-/2/;3-,文献标识码:%文章编号:!"""'',-(!((""()''"!''""/0''"0
收稿日期:("""''!(''!,;修回日期:(""!''"4''!&
作者简介:范行良(!0-"''),男,助研,中国药品生物制品检定所
0-级硕士研究生,现在中国药品生物制品检定所疫苗三室从事呼吸
道病毒疫苗检定工作.
流行性乙型脑炎[又称日本脑炎(5.6),简称乙
脑]是一种由蚊子传播的严重神经系统疾病,主要流
行于东亚和南亚各国.目前的乙脑疫苗有(类,即
灭活疫苗和减毒活疫苗.!0#&年在中国西安分离
到野毒株$%
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体[!,#].因此,目前我国选用$%
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减毒活疫苗进行预防接种,取得了良好的效果[4].
乙脑病毒为一正链17%病毒,含有/个结构
蛋白依次为8,9:;,7$/,7$&=,7$&>和7$#.目前
认为乙脑病毒的毒力,免疫原性,细胞嗜性等主要是
由结构蛋白,特别是.蛋白决定的[-''!(].
为了从分子生物学水平对疫苗弱毒力的稳定性
进行研究,本试验首次对&株乙脑病毒.基因进行
了序列比较.
材料与方法
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!&鼠脑!/代,乙脑病
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''!&''(株!-代由本所贾丽丽副研究员提供.细胞为
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(!细胞为本室保存.本试验所
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提供.
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设计针对.基因的引物.上游引物(0#&H0-&:#I''8JK
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''J88%888%LL8JJ88%8LJ8''/I.目的基因长度为!
4!/>9,由赛百盛公司合成.%;6逆转录酶,J&M7%连接
酶购自):@N G=公司.J=O)EPQ!酶购自上海生工公司.
(乳鼠脑内回传#代病毒(!)#)的制备取乳鼠一窝!"
只,脑内注射"2"(NE!"4)DR病毒.每株病毒作一组,每天
连续观察.待乳鼠明显发病时无菌取乳鼠鼠脑,冻于''
-"S.
$*+"的提取采用异硫氰酸胍一步裂解法提取细胞总
17%.
,*-%./*在"2#NE管中,依次加入下列各液并充分混
匀:!"TCPUU :("E,;G8E
(((#NN@E<A)&"E,V7J)(!"NN@E<A)
("E,1W=QFW!"E,随机引物(&"9N@E<"E)!"E,模板17%!""E,
%;6"2#"E.&(S&#NFW,00S#NFW,水浴#NFW.依次加入
;G8E
(
(#NN@E<A("E,!"TCPUU :/"E,上下游引物(!"9N@E<"E)
各#"E,无菌水!&"E,J=O)EPQ!酶!"E.0&S#"Q,##S#"Q,
-(S!2#NFW,/#个循环;-(S延伸!#NFW.
0琼脂糖凝胶电泳!X琼脂糖凝胶,稳压!""6,电泳!Y
后.C染色观察.
1./*产物的纯化用玻璃奶法进行常规纯化.
第!,卷第!期
(""(年/月
病毒学报
8*Z7.$.5BR17%ABD6Z1BABL[
6@E\!,7@\!
;=:]Y(""(
!感受态细菌的制备以!"#!$菌为宿主菌,用%&%''
(法常
规制备感受态菌.
"连接,转化,序列测定在离心管中依次加入)"''蒸馏
水,*"''*+倍连接缓冲液,("'',%-(.*载体,*"'',%-产物,
*"''/0123连接酶,*(4恒温反应056*(5.转化采用常规
方法.将连接产物转化入宿主菌!"#!$,784培养过夜.通
过蓝白斑,氨苄抗性,酶切及,%-筛选阳性质粒.序列测定
由六合通公司用双脱氧法测定.
结果
#测序结果比较
用-/9,%-分别对0株乙脑病毒:基因*)++
核苷酸(编码)++个氨基酸)进行扩增,克隆,测序,
并用计算机进行了序列比较,结果见图*.
+0 病毒学报*;卷
!" !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗#$
!"
%!"%&!基因的稳定性
!" 病毒学报#$卷
图!各毒株核苷酸序列比较
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!相应氨基酸序列比较相应编码氨基酸序列的比较见图7.
89 !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗:(
!9
;!9;7!基因的稳定性
图!各毒株间氨基酸序列比较
"#$%&''!()#$*+''*,-./+#*-/0#12''3%''*0''2-.4$''*''-..-%&2,&/#*2-.546#&%2
77 病毒学报89卷
!"#
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&$%&''不同代次病毒的(基因差异及与
野毒株的比较
!"
#$
%#$%&疫苗株在''()细胞传#*代后有
&个基因位点发生了突变,即+,%#-*.(,!/)和
+,%�-("!/)(表#),相应的氨基酸也发生了
错义突变,1%22#(!!3),1%2-4()!1)(表&).
但不是!"#$原株所具有的,也不是先前其他文献
报道[*,-,#.]的与毒力相关的#&个核苷酸和4个氨
基酸,即不是回复突变.
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株的比较
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毒株的比较
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后,与!"
#$
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苷酸和$个氨基酸的改变(表2,$),但其中只有#
个核苷酸为回复突变,其余$个非!"
#$原株所具有
的基因.表!疫苗株在乳鼠脑内回传$代碱基突变
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讨论
以往的动物试验结果表明,!"
#$
%#$%&疫苗
株早代病毒(''()%4代)通过乳鼠脑传#代或地鼠
肾细胞传#*代,即!"
#$
%#$%&(''()%#*代)病毒
对小鼠的毒力和返祖试验与''()%4代相同,无返
祖现象[#$].为了解乙脑病毒减毒活疫苗!"
#$
%#$
N$ #期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗!"
#$
%#$%&!基因的稳定性
!"在不同培养环境下弱毒稳定性的分子基础,我
们分别对野毒株#$
%&,疫苗株#$
%&
!%&!"(''()!
*代),#$
%&
!%&!"(''()!%+代)和乳鼠脑内传%
代(#$
%&
!%&!"!*,!#-
%)的&个毒株的.区基
因进行了测序比较.%//0年$12343等[%5]曾测定过
#$
%&
!%&!"的序列,通过同源性比较其结果与本
次所测定的.基因序列基本相同.说明从那时到
现在使用的疫苗在.基因上没有发生明显的变异,
即#$
%&
!%&!"株在''()细胞上连续传*代.基
因仍是稳定的.在''()细胞中继续传/代共%+代
后,#$
%&
!%&!"的.基因发生了"个新的突变(67
!%/+0,67!"%8/),并导致了相应氨基酸的改变(.
!55%,.!5/*).通过与野毒株的比较,证实此"
突变并非回复突变,理论上不应导致乙脑病毒毒力
的恢复.本试验结果从分子水平上表明目前对生产
毒种要求在''()细胞上传代次数不得超过%0次是
可行的,传代次数限定更低些是为了增加疫苗的安
全系数.
乳鼠脑是神经组织,是乙脑病毒复制的最佳场
所,病毒复制频率高,病毒滴度可达%0*90:0";
=0在%0%:090:05;<@%0":090:05;<之间,
与原#$
%&野毒株毒力(%0*:=@%0/:0)相差甚远,尤其
是对神经外感染仍无毒力[%&].因此.!%0+氨基酸
的回复突变对#$
%&
!%&!"疫苗株的毒力无重要影
响,未引起返祖.以上结果为#$
%&
!%&!"疫苗的
弱毒稳定性和安全性从基因水平上提供了依据.
结论
流行性乙型脑炎减毒活疫苗#$
%&
!%&!"在原
代地鼠肾(''())细胞传至%+代,.基因未发生回复
突变,在乳鼠脑内传代时仅发现%个回复突变位点,
可能与脑内毒力有一定回升有关,但未引起返祖.
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%&
!%&!"[C]AD3KK16F,%//%:"=/!"85A
[*]HFK1<13 ,TIL<P.$AULK<FI71PFK236QFM4FM,I6M1V<FNI4<IMMIN6FLO
4I16S3M1SF6FMM16C3,36FMFF6KF,23<171MS14LM6FL743<1W371I6!4FM1M7367
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CTF6D14I<,%//=,+8:&0/!&%5A
[%0]U1(,E344F77$ GA-I<FKL<34P1NNF4F6KFMVF7XFF6X1<P!7R,F
C3,36FMFF6KF,23<171MS14LMM74316MIN21Q236P<IX;ILMF6FL4I16S3O
M1SF6FMM[C]ACTF6D14I<,%//8,++:%&&/!%&==A
[%%](3MFQ3X3(,YIM21P3-,#21IM3Z3G,F73<A-L7371I61672F.6SFO
<I,F''4I7F16INC3,36FMF.6KF,23<171MD14LM$NNFK7M.674R167IHL<O
7L4FPHF<<M36PD14L<F6KF16-1KF[C]AD14I<IQR,%//",%/%:%=*!
%8=A
[%"]U173R3,236#,T4367CT,H236QTC,F73<AULK<FI71PFMF[LF6KFIN
S14L<F67#$
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[%5]$12343#,F73<ABPF671N1K371I6IN;L7371I67237IKKL4FPI672F
QF6I;FINC3,36FMFF6KF,23<171MS14LMPL416Q72F377F6L371I6,4IKFMM
[C]AD14LMTF6F,%//%,=:/=!%0/A
[%&]贾丽丽,郑铮,郭玉鹏,等A流行性乙型脑炎活疫苗生产毒株
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!"#$%&''()(%*+,-./+%#(01#0#+,%"#2&3&0#4#-05#3"&)(%(46(7#8%%#09&%#:
;&55(0#;(/94$8
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%&''()*+,-).*+,/0/1*+,2)*,3456,78,/&9:;),;8)
(!"#$%&"''(&)#$#*#+,%-#.+/%&#-%''%,0."-1"2+*#$2"''"&34$%''%5$2"''0-%3*2#),4+$6$&5!<<;6F6A8-CA)*E)B.C6EC;.CC;6F6M6F6CM6-D6*8B-61C)E6A.*E
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!"
#!"#$)AAC.H-6,C;.C)A
B1*A)AC6*CM)C;C;6*68F1.CC6*8.C)1*AC.H)-)CJC6AC6E)*N)B6K
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T" !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗G&
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#!"#$7基因的稳定性
391396
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%#$%&''基因的稳定性
范行良,俞永新,李德富,姚智慧
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作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检
测手段.
关键词:流行性乙型脑炎;不同传代株;.基因序列;基因稳定性
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作者简介:范行良(!0-"''),男,助研,中国药品生物制品检定所
0-级硕士研究生,现在中国药品生物制品检定所疫苗三室从事呼吸
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流行性乙型脑炎[又称日本脑炎(5.6),简称乙
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体[!,#].因此,目前我国选用$%
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''!&''(株作为
减毒活疫苗进行预防接种,取得了良好的效果[4].
乙脑病毒为一正链17%病毒,含有/个结构
蛋白依次为8,9:;,7$/,7$&=,7$&>和7$#.目前
认为乙脑病毒的毒力,免疫原性,细胞嗜性等主要是
由结构蛋白,特别是.蛋白决定的[-''!(].
为了从分子生物学水平对疫苗弱毒力的稳定性
进行研究,本试验首次对&株乙脑病毒.基因进行
了序列比较.
材料与方法
#毒种,细胞和动物乙脑病毒株$%
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''!&''(株,代(疫苗珠)均由本科室保存;乙脑病毒
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6 :@细胞及无))AB的C*+
(!细胞为本室保存.本试验所
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提供.
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设计针对.基因的引物.上游引物(0#&H0-&:#I''8JK
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''J88%888%LL8JJ88%8LJ8''/I.目的基因长度为!
4!/>9,由赛百盛公司合成.%;6逆转录酶,J&M7%连接
酶购自):@N G=公司.J=O)EPQ!酶购自上海生工公司.
(乳鼠脑内回传#代病毒(!)#)的制备取乳鼠一窝!"
只,脑内注射"2"(NE!"4)DR病毒.每株病毒作一组,每天
连续观察.待乳鼠明显发病时无菌取乳鼠鼠脑,冻于''
-"S.
$*+"的提取采用异硫氰酸胍一步裂解法提取细胞总
17%.
,*-%./*在"2#NE管中,依次加入下列各液并充分混
匀:!"TCPUU :("E,;G8E
(((#NN@E<A)&"E,V7J)(!"NN@E<A)
("E,1W=QFW!"E,随机引物(&"9N@E<"E)!"E,模板17%!""E,
%;6"2#"E.&(S&#NFW,00S#NFW,水浴#NFW.依次加入
;G8E
(
(#NN@E<A("E,!"TCPUU :/"E,上下游引物(!"9N@E<"E)
各#"E,无菌水!&"E,J=O)EPQ!酶!"E.0&S#"Q,##S#"Q,
-(S!2#NFW,/#个循环;-(S延伸!#NFW.
0琼脂糖凝胶电泳!X琼脂糖凝胶,稳压!""6,电泳!Y
后.C染色观察.
1./*产物的纯化用玻璃奶法进行常规纯化.
第!,卷第!期
(""(年/月
病毒学报
8*Z7.$.5BR17%ABD6Z1BABL[
6@E\!,7@\!
;=:]Y(""(
!感受态细菌的制备以!"#!$菌为宿主菌,用%&%''
(法常
规制备感受态菌.
"连接,转化,序列测定在离心管中依次加入)"''蒸馏
水,*"''*+倍连接缓冲液,("'',%-(.*载体,*"'',%-产物,
*"''/0123连接酶,*(4恒温反应056*(5.转化采用常规
方法.将连接产物转化入宿主菌!"#!$,784培养过夜.通
过蓝白斑,氨苄抗性,酶切及,%-筛选阳性质粒.序列测定
由六合通公司用双脱氧法测定.
结果
#测序结果比较
用-/9,%-分别对0株乙脑病毒:基因*)++
核苷酸(编码)++个氨基酸)进行扩增,克隆,测序,
并用计算机进行了序列比较,结果见图*.
+0 病毒学报*;卷
!" !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗#$
!"
%!"%&!基因的稳定性
!" 病毒学报#$卷
图!各毒株核苷酸序列比较
"#$%&''!()#$*+''*,-.*%/)''-,#0''1''2%''*/''1-.3$''*''-..-%&1,&4#*1-.536#&%1
!相应氨基酸序列比较相应编码氨基酸序列的比较见图7.
89 !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗:(
!9
;!9;7!基因的稳定性
图!各毒株间氨基酸序列比较
"#$%&''!()#$*+''*,-./+#*-/0#12''3%''*0''2-.4$''*''-..-%&2,&/#*2-.546#&%2
77 病毒学报89卷
!"#
$%
&$%&''不同代次病毒的(基因差异及与
野毒株的比较
!"
#$
%#$%&疫苗株在''()细胞传#*代后有
&个基因位点发生了突变,即+,%#-*.(,!/)和
+,%�-("!/)(表#),相应的氨基酸也发生了
错义突变,1%22#(!!3),1%2-4()!1)(表&).
但不是!"#$原株所具有的,也不是先前其他文献
报道[*,-,#.]的与毒力相关的#&个核苷酸和4个氨
基酸,即不是回复突变.
表$疫苗株在)*+细胞中培养不同代次碱基突变与野毒
株的比较
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表''疫苗株在)*+细胞中培养不同代次氨基酸突变与野
毒株的比较
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!"
#$
%#$%&(!L#)疫苗株通过乳鼠脑内#代
后,与!"
#$
%#$%&()4疫苗株相比,发生N个核
苷酸和$个氨基酸的改变(表2,$),但其中只有#
个核苷酸为回复突变,其余$个非!"
#$原株所具有
的基因.表!疫苗株在乳鼠脑内回传$代碱基突变
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表%疫苗株在乳鼠脑内回传$代氨基酸突变
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讨论
以往的动物试验结果表明,!"
#$
%#$%&疫苗
株早代病毒(''()%4代)通过乳鼠脑传#代或地鼠
肾细胞传#*代,即!"
#$
%#$%&(''()%#*代)病毒
对小鼠的毒力和返祖试验与''()%4代相同,无返
祖现象[#$].为了解乙脑病毒减毒活疫苗!"
#$
%#$
N$ #期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗!"
#$
%#$%&!基因的稳定性
!"在不同培养环境下弱毒稳定性的分子基础,我
们分别对野毒株#$
%&,疫苗株#$
%&
!%&!"(''()!
*代),#$
%&
!%&!"(''()!%+代)和乳鼠脑内传%
代(#$
%&
!%&!"!*,!#-
%)的&个毒株的.区基
因进行了测序比较.%//0年$12343等[%5]曾测定过
#$
%&
!%&!"的序列,通过同源性比较其结果与本
次所测定的.基因序列基本相同.说明从那时到
现在使用的疫苗在.基因上没有发生明显的变异,
即#$
%&
!%&!"株在''()细胞上连续传*代.基
因仍是稳定的.在''()细胞中继续传/代共%+代
后,#$
%&
!%&!"的.基因发生了"个新的突变(67
!%/+0,67!"%8/),并导致了相应氨基酸的改变(.
!55%,.!5/*).通过与野毒株的比较,证实此"
突变并非回复突变,理论上不应导致乙脑病毒毒力
的恢复.本试验结果从分子水平上表明目前对生产
毒种要求在''()细胞上传代次数不得超过%0次是
可行的,传代次数限定更低些是为了增加疫苗的安
全系数.
乳鼠脑是神经组织,是乙脑病毒复制的最佳场
所,病毒复制频率高,病毒滴度可达%0*90:0";
=0在%0%:090:05;<@%0":090:05;<之间,
与原#$
%&野毒株毒力(%0*:=@%0/:0)相差甚远,尤其
是对神经外感染仍无毒力[%&].因此.!%0+氨基酸
的回复突变对#$
%&
!%&!"疫苗株的毒力无重要影
响,未引起返祖.以上结果为#$
%&
!%&!"疫苗的
弱毒稳定性和安全性从基因水平上提供了依据.
结论
流行性乙型脑炎减毒活疫苗#$
%&
!%&!"在原
代地鼠肾(''())细胞传至%+代,.基因未发生回复
突变,在乳鼠脑内传代时仅发现%个回复突变位点,
可能与脑内毒力有一定回升有关,但未引起返祖.
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[*]HFK1<13 ,TIL<P.$AULK<FI71PFK236QFM4FM,I6M1V<FNI4<IMMIN6FLO
4I16S3M1SF6FMM16C3,36FMFF6KF,23<171MS14LM6FL743<1W371I6!4FM1M7367
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CTF6D14I<,%//=,+8:&0/!&%5A
[%0]U1(,E344F77$ GA-I<FKL<34P1NNF4F6KFMVF7XFF6X1<P!7R,F
C3,36FMFF6KF,23<171MS14LMM74316MIN21Q236P<IX;ILMF6FL4I16S3O
M1SF6FMM[C]ACTF6D14I<,%//8,++:%&&/!%&==A
[%%](3MFQ3X3(,YIM21P3-,#21IM3Z3G,F73<A-L7371I61672F.6SFO
<I,F''4I7F16INC3,36FMF.6KF,23<171MD14LM$NNFK7M.674R167IHL<O
7L4FPHF<<M36PD14L<F6KF16-1KF[C]AD14I<IQR,%//",%/%:%=*!
%8=A
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S14L<F67#$
%&
M74316INC3,36FMFF6KF,23<171MS14LM36P17M377F6L37FP
S3KK16FPF41S371SF,#$
%&
!%&!"[C]AD14I<IQR,%//0,%++:=&%!
=="A
[%5]$12343#,F73<ABPF671N1K371I6IN;L7371I67237IKKL4FPI672F
QF6I;FINC3,36FMFF6KF,23<171MS14LMPL416Q72F377F6L371I6,4IKFMM
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;&55(0#;(/94$8
!"
#!"#$
%&''()*+,-).*+,/0/1*+,2)*,3456,78,/&9:;),;8)
(!"#$%&"''(&)#$#*#+,%-#.+/%&#-%''%,0."-1"2+*#$2"''"&34$%''%5$2"''0-%3*2#),4+$6$&5!<<;6F6A8-CA)*E)B.C6EC;.CC;6F6M6F6CM6-D6*8B-61C)E6A.*E
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T" !期范行良等:流行性乙型脑炎减毒活疫苗G&
!"
#!"#$7基因的稳定性
391396
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