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放线杆菌胸膜肺炎不活化菌苗之研发
张惟茗*,林敬覆,吴义兴,萧终融
行政院农业委员会家畜卫生试验所
摘要 为进行放线杆菌胸膜肺炎不活化菌苗之研发,种菌之选殖共测试包括21株第1血清型分离株及分属第1,2,5及11血清型之4株标准株等菌株共25株,所有分离菌株均先经生化试验及血清学同定确认.菌株之筛选主要针对ApxI细胞毒素之分泌量及菌落型态进行筛选.ApxI细胞毒素之检测则以酵素免疫斑点法(使用抗ApxI毒素单源抗体检测)及溶血力价测定等两种方式进行.在25株菌株中,21株为平滑型菌落,2株为粗糙型,2株为黏液型.以酵素免疫斑点法检测菌株之ApxI毒素分泌,结果力价之分布由阴性至1:256,差异相当大.菌株溶血力价之分布则由阴性至1:32.不同菌株在酵素免疫斑点法力价或溶血力价与培养於血液培养基所产生之溶血圈大小一致.最后选殖之种菌为第1血清型分离株,菌落为黏液型,酵素免疫斑点法力价及溶血力价分别为1:256及1:32.以猪胸膜肺炎放线杆菌第1血清型种菌进行大量培养所得之菌液,再利用硫酸铵浓缩后检测其毒素含量减少低於10%,但是毒素活性却大幅降低,减少超过90%.将菌液不活化后添加商品化油质佐剂之试制菌苗所进行之特性试验,纯粹试验,无菌试验及安全试验等之结果均符合动物用药品检验标准之规定.试制菌苗所进行之效力试验,计算试制菌苗之防御指数为1.41,高於标准.
关键字:胸膜肺炎放线杆菌,毒素,疫苗
绪 言
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap) 属一种溶血性革兰氏阴性菌,感染后可引起猪出血性纤维素性胸膜肺炎.台湾在1976年首次报告以来 [2],目前已蔓延全省,发生率极高.1981年在生长肥育猪调查中,发现以本病之感染为最主要 [3].而本菌血清型的复杂和其它细菌,病毒的混合感染使得本病更难控制,也造成极大之经济损失,因此本病的控制亟待解决.抗生素的使用虽可延迟本病的发生和降低感染猪的死亡率,但一旦停药,本病将再度爆发.因此本病的防治应以疫苗免疫为主.但一般不活化菌苗往往仅能减少猪群的死亡率,而不能阻止慢性感染 [4].由於在Ap的致病机制中,毒素不但扮演著重要的脚色同时也是重要的保护抗原,实验显示猪免疫两次含Apx 细胞毒素及transferrin-binding proteins的次单位疫苗,能有效保护猪耐过Ap的攻击及减少肺部病变 [8] .因此本实验之目的即在於研发添加重要毒素的菌苗,希望对於本病之防治能有所助益.
材料与方法
菌株,培养方法与细胞毒素制备
所使用的菌株共25株,包括21株Ap第1血清型分离株及4株分属第1,2,5及11血清型之标准株 (ATCC27088, 27089, 33377, 53153 ) ,所有分离菌株均经生化试验及血清学同定确认.细菌培养方法是接种於含0.01% NAD之 tryptic soy broth (DIFCO),或含0.01% NAD及5% 脱纤绵羊血之tryptic soy agar (DIFCO) 置於37℃,10％CO2之恒温培养箱培养18个小时.培养於固体血液培养基之菌落需观察型态及溶血圈大小.细胞毒素制备是将25株菌株培养后的培养液,以7000 rpm 离心15分钟后取上清液,再以0.45μm过滤膜过滤后进行下述力价分析.
细胞毒素之浓缩与粗纯化
细胞毒素制备是将培养液,以7000 rpm 离心15分钟后取上清液,再进行浓缩与粗纯化.硫酸铵浓缩是将上清液1000 mL缓缓加入等量饱和浓度的硫酸铵溶液(767g/L,25℃),4 ℃下搅拌2个小时,再以7000 rpm 离心30分钟.将沉淀物以蒸馏水再溶解后装入透稀袋中(MWCO 12000-14000)以0.15 M 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS) 透析,此即为浓缩之细胞毒素.所得之浓缩液再分别以斑点免疫法检测毒素量,以溶血试验检测毒素活性.
酵素免疫斑点法 (dot blot assay)
将制备之25株菌株的细胞毒素作2倍阶梯稀释后取0.1 mL,使用96孔 Bio-dot (Bio-Rad) 滴於硝化纤维纸 (0.45m nitrocellulose paper,Schleicher& Schuell) 上,烘乾后浸泡於填塞溶液 (含10%脱脂奶之0.15M PBS ) 37 ℃,15分钟后,以清洗液 (0.05%Tween 20 in 0.15M PBS) 清洗3次后,用稀释1000倍之Ap抗细胞毒素 (ApxI) 单源抗体 (老鼠腹水) 在37 ℃下感作30分钟.接著再以清洗液清洗3次后 (每次15分钟), 与稀释1000倍之抗鼠IgG过氧化氢 (horseradish peroxidase, HRP) 标示抗体 (Jackson) 感作 (37 ℃,30分钟).再以清洗液清洗3次后,最后以3-3'diaminobenzidine (0.1% in 0.05 M Tris buffer) (Sigma) 呈色后判定.
溶血试验
溶血试验是将制备之25株菌株的细胞毒素取0.5 mL后,以barbitone- buffered saline作两倍稀释, 再加0.5 mL溶於barbitone-buffered saline之0.5 %绵羊红血球溶液.充分振荡混合后,先置37 ℃,1小时,再置於4 ℃,1小时后判定.
细胞毒素免疫原之制备及免疫
细胞毒素免疫原之制备是将上述细胞毒素溶液1000 mL缓缓加入等量饱和硫酸铵溶液 (767 g/L,25 ℃),4℃下搅拌2个小时,再以7000 rpm 离心30分钟.将沉淀物以100mL蒸馏水再溶解后装入透稀袋中 (MWCO 12000-14000) 以0.15 M 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,PBS) 透析,即为浓缩10倍之细胞毒素免疫原.
不活化菌苗之制备
将培养所得之菌液添加0.3 %福马林,置於37 ℃作用1小时,进行不活化.细菌及细胞毒素之浓缩与粗纯化采用上述方法进行.细菌最终浓度约为1010 pfu/mL,佐剂选用商品化油质佐剂Emulsigen (MVP),与抗原比例为1:4.
试制不活化菌苗之特性试验,纯粹试验及无菌试验
将试制完成之菌液观察外观,抽取部份以革兰染色进行菌体镜检,并分别以巧克力培养基及Tryptic soy agar培养,以进行特性试验及纯粹试验.不活化后之菌液及混合佐剂后之试制不活化菌苗再分别接种 Soy bean casein digest (TSB) 及Fluid thioglycolate (THIO)培养液进行无菌试验.
安全试验
以体重约12公克健康小白鼠40只,各以试制不活化菌苗腹腔接种0.5 mL,另取40只为对照,观察2周.另以体重约350公克健康天竺鼠2只,各以本剂皮下接种1 mL,观察10日.
效力试验
将安全试验合格之免疫小白鼠,分成四组,各组分别以强毒菌株培养液之100至10-3四阶段菌液接种腹腔攻击;对照小白鼠亦分成四组,各组分别以10-1至10-4四阶段菌液接种於腹腔内,观察一周,计算 LD50及防御指数.
结 果
实验中所测试的25株菌株的菌落形态及培养特性均符合Ap的特性,使用标准血清型抗血清也都能产生特异性凝集.其中21株菌株之菌落型态属於平滑型,2株分离株属粗糙型,2株分离株属於黏液型.在含脱纤绵羊血之血液培养基中,不同菌株之溶血圈大小各不相同,有部份菌株甚至没有明显溶血圈.
利用抗ApxI细胞毒素单源抗体以酵素免疫斑点法检测菌株之细胞毒素分泌量,测定结果力价分布介於阴性至1:256间,其中阴性占24 %,力价1:2占16 %,1:4占16 %,1:8占16 %,1:64占12 %,1:128占8 %,1:256占8 %.利用溶血试验所测得之细胞毒素溶血力价介於阴性至1:32之间.酵素免疫斑点法力价1:256之对应溶血力价为1:32,1:128及1:64之对应溶血力价为1:16.菌株在含脱纤绵羊血之血液培养基所呈现之溶血圈大小与酵素免疫斑点法及溶血试验力价高低一致.综合以上菌落型态及细胞毒素分泌量,以Ap第1血清型分离株8611为理想的种株,因8611属黏液型菌落型态,溶血圈大,清澈(透明),酵素免疫斑点法及溶血试验力价分别为1:256及1:32.
以种菌进行大量培养所得之菌液,再利用50 %硫酸铵浓缩后,利用斑点免疫法检测其毒素含量,结果浓缩后之力价减少低於10 %.但是利用绵羊红血球检测其毒素活性(溶血力价),结果毒素活性减少超过90 %.
试制不活化菌苗为微黄乳白悬浮乳剂,无异物及异常气味.纯粹试验结果,培养后菌液经以革兰氏染色法镜检,可检视到呈红色单一型态之短杆菌,以巧克力培养基可培养出单一型态之白色黏液状小菌落,Tryptic soy agar培养则呈阴性反应,显示菌液不含有本菌以外之细菌.不活化后之菌液及添加佐剂后之试制菌苗以TSB及THIO培养,细菌培养结果均为阴性.以小白鼠及天竺鼠所进行之安全试验,试制不活化菌苗施打后均无出现死亡情形.小白鼠实验组於施打后约1小时,小白鼠之活动力明显降低,但24小时后观察已恢复正常.
试制菌苗所进行之效力试验结果如表一,实验组以菌液原液攻击后小白鼠存活2只,稀释10倍菌液攻击后存活6只,稀释100倍以下则全数存活.对照组以菌液稀释10倍攻击后小白鼠全数死亡,稀释100倍菌液攻击后存活5只,稀释1000倍以下菌液攻击则全数存活.估算试制菌苗之防御指数为1.41.因此由特性试验,纯粹试验,无菌试验,安全试验及效力试验等之结果均符合国家动物用药品检验标准 (民国 92 年 01 月 15 日 修正) 第58节猪嗜血杆菌苗检验标准之规定[1].
表一.猪胸膜肺炎试制不活化菌苗之效力试验结果
攻击用菌液
稀释倍数*
实验组％
(存活头数) **
对照组％
(存活头数) **
100
20(2)
ND
10-1
60(6)
0(0)
10-2
100(10)
50(5)
10-3
100(10)
100(10)
10-4
ND
100(10)
* 免疫菌苗后两周以不同强毒菌株培养液稀释倍数接种於腹腔内攻击.
**小白鼠每组10只,实验组与对照组比较,防御力价约为1.41.
讨 论
Ap引起的主要病变为出血性,坏死性纤维素性肺炎,以ApxI细胞毒素或脂多醣接种实验动物都会引起类似病变.ApxI细胞毒素及脂多醣内毒素不仅为主要的致病因子也是重要的保护因子.ApxI N-端 40 to 380bp被证实可中和毒素之溶血反应,由此部位所合成之次单位疫苗具有保护能力,对於不同血清型菌也同时具有交叉保护能力 [7].因此在Ap疫苗种菌的选殖上,ApxI细胞毒素的分泌量及脂多醣链的长度均是一个重要的决定因素.具完整的脂多醣链其菌落型态为黏液型,脂多醣链变短则菌落型态转为平滑型,脂多醣的多醣链掉落后菌落型态则呈粗糙型.基於以上因素,实验中疫苗种株选殖是从25株本地分离株进行筛选,选殖之种株为黏液型菌落型态,溶血圈大,清澈,酵素免疫斑点法及溶血试验力价分别为1:256及1:32.
由实验结果显示所试制之菌苗在特性试验,纯粹试验,无菌试验及安全试验等之结果均符合国家动物用药品检验标准之规定.试制菌苗所进行之效力试验,计算试制菌苗之防御指数为1.41,高於检验标准.但是在菌苗制备时细胞毒素之浓缩过程会使毒素活性大幅衰退,根据先前实验显示此种衰退会严重影响毒素抗原之保护效果,因此亟待有效方法改善之.
此外由於Ap属於革兰氏阴性菌,不活化菌苗内富含内毒素,再加上所添加之细胞毒素 (外毒素) 及佐剂使得试制菌苗之副作用虽然尚符合国家检定标准但仍有改善空间.而菌苗副作用的降低,在临床使用上有其重要性.实验显示施打菌苗 (Ap及M. hyopneumoniae) 后所产生的副作用,会促使猪感染第2型环状病毒 (porcine circovirus type 2 ,PCV2) 后的毒血期,血中病毒量,组织中病毒分布及病变严重性都明显增加 [6].
菌苗所使用的佐剂是影响其副作用的重要因素.铝胶及油质佐剂是制造动物疫苗常被使用的佐剂,一般来说它们是相当安全地.但是无可避免地还是会引起程度不一的副作用例如局部组织炎症反应或过敏反应.不同免疫原由於组成不同,引起反应的严重性也各不相同.降低内毒素热原的全身热反应是铝胶类佐剂的优点之一,主要机制为降低热原的释放及/或铝离子对於热原的直接抑制,而氯化铝的抑制效果较氢氧化铝强 [5].但是铝胶类佐剂诱发之免疫强度及持续性均不及油质佐剂.本实验中所使用的油质佐剂免疫兔子后产生持续2天的发烧及局部发炎及坏死等反应,因此选择及试用其它更适当之佐剂,可能有助於菌苗副作用的改善.
参考文献
中华民国动物用药品检验标准」 (民国92年1月15日修正)第三章第五八节猪嗜血杆菌苗检验标准.http://www.coa.gov.tw/law/lawsystem/down_2/G/8.htm
徐兴鎔,翁仲男,周凝元,金约翰,韩海伦.1976.猪嗜血杆菌肺炎在台湾之流行报告.台糖公司畜产研究所64/65年期研究试验报告,191-197页.
张靖男,沈咏梅,钟文彬,严家清,1981,生长肥育猪肺炎细菌学之研究,台糖公司畜产研究所69/70年期研究试验报告,181-188页.
Fenwick, B.W. et al. 1986b. Motality in swine herd endemically in fected with H. pleuropneumoniae: effect of immunization with cross-reacting LPS core antigens of E. coli. Am. J. Vet. Res . 47:1888-1891
Norimatsu M, Ogikibo Y, Aoki A, Takahashi T, Watanabe G, Taya K, Sasamoto S, Tsuchiya M, Tamura Y. Effects of aluminum adjuvant on systemic reactions of lipopolysaccharides in swine. Vaccine 1995 13(14):1325-1329
Opriessnig T, Yu S, Gallup JM, Evans RB, Fenaux M, Pallares F, Thacker EL, Brockus CW, Ackermann MR, Thomas P, Meng XJ, Halbur PG. Effect of vaccination with selective bacterins on conventional pigs infected with type 2 porcine circovirus. Vet Pathol. 2003 Sep;40(5):521-9
Seah JN, Frey J, Kwang J. The N-terminal domain of RTX toxin ApxI of Actinobacillus pleuropneumoniae elicits protective immunity in mice. Infect Immun. 2002 Nov;70(11):6464-7.
Van Overbeke I, Chiers K, Ducatelle R, Haesebrouck F. Effect of endobronchial challenge with Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 9 of pigs vaccinated with a vaccine containing Apx toxins and transferrin-binding proteins. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2001 Feb;48(1):15-20
Development of an Actinobacillus pleuropneumoniae inactivated vaccine
Chang, WM*, YS Wu, KF Lin and JR Shiau
Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive of Yaun
A selection of a seed strain for development of Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap) vaccine was made from 4 type strains and 21 field strains. Among 25 strains, 21 strains were smooth type, 2 were rough type and 2 were mucus type according colony morphology. The criteria of the selection were based on the secretion of ApxI toxin, since it was one of the major factors of pathogenesis, and on colony morphology. The detection of ApxI toxin was made by immnoblotting test and hemolytic test. The distribution of titer by immnoblotting test and hemolytic test were from negative to 1:256 and from negative to 1:32, respectively. It was coordinated with the hemolytic zone appeared in blood agar cultured. The seed strain selected was a field isolate in 1997 with titer of 1:256 and 1:32 tested by above tests.The cytotoxin contained in culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 was concentrated by salting out of ammonium sulfate. The amounts of cytotoxin were lost less than 10% after concentration process when measured by immuno-blotting assay. However, the biological activity of cytotoxin was decreased greatly for more then 90% when detected by hemolytic test. The physical properties, purity, sterility, and safety of prepared inactivated vaccine with addition of a commercialized oil adjuvant were all fit the national corresponding regulation. The evaluation of protective efficacy of prepared bacterin was done by mice protection test. The protective index was 1.41 and the inactivated vaccine was proved to be effective.
Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae, toxin, vaccine
放线杆菌胸膜肺炎不活化菌苗之研发
张惟茗,林敬覆,吴义兴,萧终融
*抽印本索取作者
行政院农业委员会家畜卫生试验所
*Corresponding Author
Animal Health Research Institute
13777
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张惟茗*,林敬覆,吴义兴,萧终融
行政院农业委员会家畜卫生试验所
摘要 为进行放线杆菌胸膜肺炎不活化菌苗之研发,种菌之选殖共测试包括21株第1血清型分离株及分属第1,2,5及11血清型之4株标准株等菌株共25株,所有分离菌株均先经生化试验及血清学同定确认.菌株之筛选主要针对ApxI细胞毒素之分泌量及菌落型态进行筛选.ApxI细胞毒素之检测则以酵素免疫斑点法(使用抗ApxI毒素单源抗体检测)及溶血力价测定等两种方式进行.在25株菌株中,21株为平滑型菌落,2株为粗糙型,2株为黏液型.以酵素免疫斑点法检测菌株之ApxI毒素分泌,结果力价之分布由阴性至1:256,差异相当大.菌株溶血力价之分布则由阴性至1:32.不同菌株在酵素免疫斑点法力价或溶血力价与培养於血液培养基所产生之溶血圈大小一致.最后选殖之种菌为第1血清型分离株,菌落为黏液型,酵素免疫斑点法力价及溶血力价分别为1:256及1:32.以猪胸膜肺炎放线杆菌第1血清型种菌进行大量培养所得之菌液,再利用硫酸铵浓缩后检测其毒素含量减少低於10%,但是毒素活性却大幅降低,减少超过90%.将菌液不活化后添加商品化油质佐剂之试制菌苗所进行之特性试验,纯粹试验,无菌试验及安全试验等之结果均符合动物用药品检验标准之规定.试制菌苗所进行之效力试验,计算试制菌苗之防御指数为1.41,高於标准.
关键字:胸膜肺炎放线杆菌,毒素,疫苗
绪 言
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap) 属一种溶血性革兰氏阴性菌,感染后可引起猪出血性纤维素性胸膜肺炎.台湾在1976年首次报告以来 [2],目前已蔓延全省,发生率极高.1981年在生长肥育猪调查中,发现以本病之感染为最主要 [3].而本菌血清型的复杂和其它细菌,病毒的混合感染使得本病更难控制,也造成极大之经济损失,因此本病的控制亟待解决.抗生素的使用虽可延迟本病的发生和降低感染猪的死亡率,但一旦停药,本病将再度爆发.因此本病的防治应以疫苗免疫为主.但一般不活化菌苗往往仅能减少猪群的死亡率,而不能阻止慢性感染 [4].由於在Ap的致病机制中,毒素不但扮演著重要的脚色同时也是重要的保护抗原,实验显示猪免疫两次含Apx 细胞毒素及transferrin-binding proteins的次单位疫苗,能有效保护猪耐过Ap的攻击及减少肺部病变 [8] .因此本实验之目的即在於研发添加重要毒素的菌苗,希望对於本病之防治能有所助益.
材料与方法
菌株,培养方法与细胞毒素制备
所使用的菌株共25株,包括21株Ap第1血清型分离株及4株分属第1,2,5及11血清型之标准株 (ATCC27088, 27089, 33377, 53153 ) ,所有分离菌株均经生化试验及血清学同定确认.细菌培养方法是接种於含0.01% NAD之 tryptic soy broth (DIFCO),或含0.01% NAD及5% 脱纤绵羊血之tryptic soy agar (DIFCO) 置於37℃,10％CO2之恒温培养箱培养18个小时.培养於固体血液培养基之菌落需观察型态及溶血圈大小.细胞毒素制备是将25株菌株培养后的培养液,以7000 rpm 离心15分钟后取上清液,再以0.45μm过滤膜过滤后进行下述力价分析.
细胞毒素之浓缩与粗纯化
细胞毒素制备是将培养液,以7000 rpm 离心15分钟后取上清液,再进行浓缩与粗纯化.硫酸铵浓缩是将上清液1000 mL缓缓加入等量饱和浓度的硫酸铵溶液(767g/L,25℃),4 ℃下搅拌2个小时,再以7000 rpm 离心30分钟.将沉淀物以蒸馏水再溶解后装入透稀袋中(MWCO 12000-14000)以0.15 M 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS) 透析,此即为浓缩之细胞毒素.所得之浓缩液再分别以斑点免疫法检测毒素量,以溶血试验检测毒素活性.
酵素免疫斑点法 (dot blot assay)
将制备之25株菌株的细胞毒素作2倍阶梯稀释后取0.1 mL,使用96孔 Bio-dot (Bio-Rad) 滴於硝化纤维纸 (0.45m nitrocellulose paper,Schleicher& Schuell) 上,烘乾后浸泡於填塞溶液 (含10%脱脂奶之0.15M PBS ) 37 ℃,15分钟后,以清洗液 (0.05%Tween 20 in 0.15M PBS) 清洗3次后,用稀释1000倍之Ap抗细胞毒素 (ApxI) 单源抗体 (老鼠腹水) 在37 ℃下感作30分钟.接著再以清洗液清洗3次后 (每次15分钟), 与稀释1000倍之抗鼠IgG过氧化氢 (horseradish peroxidase, HRP) 标示抗体 (Jackson) 感作 (37 ℃,30分钟).再以清洗液清洗3次后,最后以3-3'diaminobenzidine (0.1% in 0.05 M Tris buffer) (Sigma) 呈色后判定.
溶血试验
溶血试验是将制备之25株菌株的细胞毒素取0.5 mL后,以barbitone- buffered saline作两倍稀释, 再加0.5 mL溶於barbitone-buffered saline之0.5 %绵羊红血球溶液.充分振荡混合后,先置37 ℃,1小时,再置於4 ℃,1小时后判定.
细胞毒素免疫原之制备及免疫
细胞毒素免疫原之制备是将上述细胞毒素溶液1000 mL缓缓加入等量饱和硫酸铵溶液 (767 g/L,25 ℃),4℃下搅拌2个小时,再以7000 rpm 离心30分钟.将沉淀物以100mL蒸馏水再溶解后装入透稀袋中 (MWCO 12000-14000) 以0.15 M 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline,PBS) 透析,即为浓缩10倍之细胞毒素免疫原.
不活化菌苗之制备
将培养所得之菌液添加0.3 %福马林,置於37 ℃作用1小时,进行不活化.细菌及细胞毒素之浓缩与粗纯化采用上述方法进行.细菌最终浓度约为1010 pfu/mL,佐剂选用商品化油质佐剂Emulsigen (MVP),与抗原比例为1:4.
试制不活化菌苗之特性试验,纯粹试验及无菌试验
将试制完成之菌液观察外观,抽取部份以革兰染色进行菌体镜检,并分别以巧克力培养基及Tryptic soy agar培养,以进行特性试验及纯粹试验.不活化后之菌液及混合佐剂后之试制不活化菌苗再分别接种 Soy bean casein digest (TSB) 及Fluid thioglycolate (THIO)培养液进行无菌试验.
安全试验
以体重约12公克健康小白鼠40只,各以试制不活化菌苗腹腔接种0.5 mL,另取40只为对照,观察2周.另以体重约350公克健康天竺鼠2只,各以本剂皮下接种1 mL,观察10日.
效力试验
将安全试验合格之免疫小白鼠,分成四组,各组分别以强毒菌株培养液之100至10-3四阶段菌液接种腹腔攻击;对照小白鼠亦分成四组,各组分别以10-1至10-4四阶段菌液接种於腹腔内,观察一周,计算 LD50及防御指数.
结 果
实验中所测试的25株菌株的菌落形态及培养特性均符合Ap的特性,使用标准血清型抗血清也都能产生特异性凝集.其中21株菌株之菌落型态属於平滑型,2株分离株属粗糙型,2株分离株属於黏液型.在含脱纤绵羊血之血液培养基中,不同菌株之溶血圈大小各不相同,有部份菌株甚至没有明显溶血圈.
利用抗ApxI细胞毒素单源抗体以酵素免疫斑点法检测菌株之细胞毒素分泌量,测定结果力价分布介於阴性至1:256间,其中阴性占24 %,力价1:2占16 %,1:4占16 %,1:8占16 %,1:64占12 %,1:128占8 %,1:256占8 %.利用溶血试验所测得之细胞毒素溶血力价介於阴性至1:32之间.酵素免疫斑点法力价1:256之对应溶血力价为1:32,1:128及1:64之对应溶血力价为1:16.菌株在含脱纤绵羊血之血液培养基所呈现之溶血圈大小与酵素免疫斑点法及溶血试验力价高低一致.综合以上菌落型态及细胞毒素分泌量,以Ap第1血清型分离株8611为理想的种株,因8611属黏液型菌落型态,溶血圈大,清澈(透明),酵素免疫斑点法及溶血试验力价分别为1:256及1:32.
以种菌进行大量培养所得之菌液,再利用50 %硫酸铵浓缩后,利用斑点免疫法检测其毒素含量,结果浓缩后之力价减少低於10 %.但是利用绵羊红血球检测其毒素活性(溶血力价),结果毒素活性减少超过90 %.
试制不活化菌苗为微黄乳白悬浮乳剂,无异物及异常气味.纯粹试验结果,培养后菌液经以革兰氏染色法镜检,可检视到呈红色单一型态之短杆菌,以巧克力培养基可培养出单一型态之白色黏液状小菌落,Tryptic soy agar培养则呈阴性反应,显示菌液不含有本菌以外之细菌.不活化后之菌液及添加佐剂后之试制菌苗以TSB及THIO培养,细菌培养结果均为阴性.以小白鼠及天竺鼠所进行之安全试验,试制不活化菌苗施打后均无出现死亡情形.小白鼠实验组於施打后约1小时,小白鼠之活动力明显降低,但24小时后观察已恢复正常.
试制菌苗所进行之效力试验结果如表一,实验组以菌液原液攻击后小白鼠存活2只,稀释10倍菌液攻击后存活6只,稀释100倍以下则全数存活.对照组以菌液稀释10倍攻击后小白鼠全数死亡,稀释100倍菌液攻击后存活5只,稀释1000倍以下菌液攻击则全数存活.估算试制菌苗之防御指数为1.41.因此由特性试验,纯粹试验,无菌试验,安全试验及效力试验等之结果均符合国家动物用药品检验标准 (民国 92 年 01 月 15 日 修正) 第58节猪嗜血杆菌苗检验标准之规定[1].
表一.猪胸膜肺炎试制不活化菌苗之效力试验结果
攻击用菌液
稀释倍数*
实验组％
(存活头数) **
对照组％
(存活头数) **
100
20(2)
ND
10-1
60(6)
0(0)
10-2
100(10)
50(5)
10-3
100(10)
100(10)
10-4
ND
100(10)
* 免疫菌苗后两周以不同强毒菌株培养液稀释倍数接种於腹腔内攻击.
**小白鼠每组10只,实验组与对照组比较,防御力价约为1.41.
讨 论
Ap引起的主要病变为出血性,坏死性纤维素性肺炎,以ApxI细胞毒素或脂多醣接种实验动物都会引起类似病变.ApxI细胞毒素及脂多醣内毒素不仅为主要的致病因子也是重要的保护因子.ApxI N-端 40 to 380bp被证实可中和毒素之溶血反应,由此部位所合成之次单位疫苗具有保护能力,对於不同血清型菌也同时具有交叉保护能力 [7].因此在Ap疫苗种菌的选殖上,ApxI细胞毒素的分泌量及脂多醣链的长度均是一个重要的决定因素.具完整的脂多醣链其菌落型态为黏液型,脂多醣链变短则菌落型态转为平滑型,脂多醣的多醣链掉落后菌落型态则呈粗糙型.基於以上因素,实验中疫苗种株选殖是从25株本地分离株进行筛选,选殖之种株为黏液型菌落型态,溶血圈大,清澈,酵素免疫斑点法及溶血试验力价分别为1:256及1:32.
由实验结果显示所试制之菌苗在特性试验,纯粹试验,无菌试验及安全试验等之结果均符合国家动物用药品检验标准之规定.试制菌苗所进行之效力试验,计算试制菌苗之防御指数为1.41,高於检验标准.但是在菌苗制备时细胞毒素之浓缩过程会使毒素活性大幅衰退,根据先前实验显示此种衰退会严重影响毒素抗原之保护效果,因此亟待有效方法改善之.
此外由於Ap属於革兰氏阴性菌,不活化菌苗内富含内毒素,再加上所添加之细胞毒素 (外毒素) 及佐剂使得试制菌苗之副作用虽然尚符合国家检定标准但仍有改善空间.而菌苗副作用的降低,在临床使用上有其重要性.实验显示施打菌苗 (Ap及M. hyopneumoniae) 后所产生的副作用,会促使猪感染第2型环状病毒 (porcine circovirus type 2 ,PCV2) 后的毒血期,血中病毒量,组织中病毒分布及病变严重性都明显增加 [6].
菌苗所使用的佐剂是影响其副作用的重要因素.铝胶及油质佐剂是制造动物疫苗常被使用的佐剂,一般来说它们是相当安全地.但是无可避免地还是会引起程度不一的副作用例如局部组织炎症反应或过敏反应.不同免疫原由於组成不同,引起反应的严重性也各不相同.降低内毒素热原的全身热反应是铝胶类佐剂的优点之一,主要机制为降低热原的释放及/或铝离子对於热原的直接抑制,而氯化铝的抑制效果较氢氧化铝强 [5].但是铝胶类佐剂诱发之免疫强度及持续性均不及油质佐剂.本实验中所使用的油质佐剂免疫兔子后产生持续2天的发烧及局部发炎及坏死等反应,因此选择及试用其它更适当之佐剂,可能有助於菌苗副作用的改善.
参考文献
中华民国动物用药品检验标准」 (民国92年1月15日修正)第三章第五八节猪嗜血杆菌苗检验标准.http://www.coa.gov.tw/law/lawsystem/down_2/G/8.htm
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张靖男,沈咏梅,钟文彬,严家清,1981,生长肥育猪肺炎细菌学之研究,台糖公司畜产研究所69/70年期研究试验报告,181-188页.
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Development of an Actinobacillus pleuropneumoniae inactivated vaccine
Chang, WM*, YS Wu, KF Lin and JR Shiau
Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive of Yaun
A selection of a seed strain for development of Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap) vaccine was made from 4 type strains and 21 field strains. Among 25 strains, 21 strains were smooth type, 2 were rough type and 2 were mucus type according colony morphology. The criteria of the selection were based on the secretion of ApxI toxin, since it was one of the major factors of pathogenesis, and on colony morphology. The detection of ApxI toxin was made by immnoblotting test and hemolytic test. The distribution of titer by immnoblotting test and hemolytic test were from negative to 1:256 and from negative to 1:32, respectively. It was coordinated with the hemolytic zone appeared in blood agar cultured. The seed strain selected was a field isolate in 1997 with titer of 1:256 and 1:32 tested by above tests.The cytotoxin contained in culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 was concentrated by salting out of ammonium sulfate. The amounts of cytotoxin were lost less than 10% after concentration process when measured by immuno-blotting assay. However, the biological activity of cytotoxin was decreased greatly for more then 90% when detected by hemolytic test. The physical properties, purity, sterility, and safety of prepared inactivated vaccine with addition of a commercialized oil adjuvant were all fit the national corresponding regulation. The evaluation of protective efficacy of prepared bacterin was done by mice protection test. The protective index was 1.41 and the inactivated vaccine was proved to be effective.
Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae, toxin, vaccine
放线杆菌胸膜肺炎不活化菌苗之研发
张惟茗,林敬覆,吴义兴,萧终融
*抽印本索取作者
行政院农业委员会家畜卫生试验所
*Corresponding Author
Animal Health Research Institute
13777
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