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马传染性贫血病(简称马传贫GB/T 17494-1998
前言
马传染性贫血病(简称马传贫,下同)的流行,曾给我国养马业造成巨大的经济损失.经过多年的防
制,在全国范围内取得显著成效,已达到控制标准.为消灭马传贫,提供一个先进有效,特异敏感,反应快
速,操作方便,易于推广的检测方法,是十分必要的.为此制定马传染性贫血病间接ELISA技术规程.
马传贫间接ELISA技术自1983年建立以来,已在全国主要养马省区推广应用十余年之久,在马传
贫防制工作中发挥了重要作用.特别是研制的试剂实现了标准化,商品化,并以低耗优质的产品质量,为
该方法推广应用奠定了基础,在这方面我们已走在世界前列.
本标准的附录A,附录B,附录C都是标准的附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由中华人民共和国农业部畜牧兽医司归口.
本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草.
本标准起草人:戴玉坤.
中华人民共和国国家标准
马传染性贫血病间接ELISA技术规程GB/''f 17494-1998
Rules of indirect ELISA technique
for equine infectious anemia disease
1范围 本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA技术规程的测定原理,仪器设备,试剂,配制溶液,操作
步骤,结果判定.
本标准适用于检测马血清中的马传贫疫毒抗体.可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马
匹的检疫,马传贫病马的定性;也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定.
2引用标准
下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文.本标准出版时,所示版本均
为有效.所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性.
NY 127-1987马传贫酶联免疫吸附试验(ELISA间接法)抗原,酶标记抗体制造及检验试行规
程
3测定原理
用特制的马传贫病毒抗原(NY 127),包被聚苯乙烯微量板孔,使免疫反应在固相载体上进行.当被
检血清中有马传贫病毒抗体存在时,则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物,再与酶标记的抗体(抗马
免疫球蛋白)反应,最后通过测定酶作用底物催化后的产物,进行定性,定量抗体测定.
4仪器设备
吸管:1 mL,5 mL,10 mL;
量桶:50 mL,100 mL,1 000 mL;
烧杯:50 mL,100 mL;
玻璃滴管:每滴体积约20^-30 pL;
血清稀释板:2.孔板每孔容积为1 mL;
定量加液器:1 mL分装定量;
微量吸液器:50 pL,100 pL;
分析天平:感量..001 g;
托盘夭平:感量..01 g;
水浴锅;
酶标测试仪.
5试荆除特别注明外,所用试剂皆为分析纯.
国家质f技术监督局1998一08一31批准1999一01一01实施
GB/''r 17494-1998
磷酸氢二钠;
磷酸二氢钠;
氯化钠;
柠檬酸;
磷苯二胺(化学纯);
过氧化氢(浓度30%);
吐温-20(Tween-20);
白明胶(Gelatin white) (E. Merck);
健康牛血清(无污染);
浓硫酸(纯度95%-98%);
酶标记抗体(冻干品,活性和特异性应符合NY 127,见附录A);
马传贫病毒抗原包被板(活性和特异性应符合NY 127,见附录B);
阴性及阳性对照血清(冻干品,活性和特异应符合NY 127).
6配制溶液
6.1磷酸盐缓冲液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS)
6.1.1 0. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(NaiHPO, 12HzO) 71. 64 g,先加适量的去离子
水加热溶解,最后定容至1 000 mL,混匀.
6.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液:称取磷酸二氢钠(NaH,PO, " 2H,O) 31. 21 g,先加适量的去离子水
加热溶解,最后定容至1 000 mL,混匀.
6.1.3量取..2 mol/L磷酸氢二钠溶液360 mL,0. 2 mol/L磷酸二氢钠溶液140 mL,称取氯化钠
38 g,混在一起,用去离子水溶解稀至5 000 ml-,
6.2洗液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS-0. 05%吐9-20)
量取0. 02 mol/L pH7. 2 PBS 1 000 mL,加入0. 5 mL吐温-20,混匀.
6.3血清及酶标记抗体稀释液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS-0. 05%吐温-20-0.1%白明胶-10%健康牛血
清) 量取洗液((6.2)100 mL,加入100 mg白明胶加热溶解,冷却后量取90 mL,加人健康牛血清10 mL,
混匀.
6.4底物溶液(pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液,内含..04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)
6.4.1 pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液:称取柠檬酸(CsHsO, H20)21.01 g,用去离子水溶解,定容至
1 000 mL.量取243 mL与.. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液(6.1.1)257 mL混合,于4℃冰箱中保存不超过
一周.
6.4.2称取40 mg邻苯二胺,溶于100 mL pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液((6.4.1)中(用前从4℃冰箱中
取出,在室温下放置20^-30 min平衡温度),待溶解后,加人150 pL过氧化氢混匀.根据试验所需量按
此比例增减.现用现配,剩余液废弃.
6.5终止剂:2 mol/L硫酸
量取浓硫酸4 mL加入32 mL去离子水中,混匀.
了操作步骤
了.1洗板
去掉抗原包被板的密封条及板孔保护膜,向各孔注入洗液,浸泡约3 min,甩干,再重新注入洗液
重复洗下次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打吸干.
了.2加被检血清及对照血清
GB/T 17494-1998
将被检血清登记编号后,用50 pL微量吸液器依次各取50 pL加人到血清稀释板的各孔内(每份血
清各用1个加样嘴).用定量加液器,将.95 mL的稀释液(6.3)依次加人装有血清的各孔内,使血清做
1120倍稀释.混匀后用100 pL微量吸液器将被检血清依次加人抗原包被板孔内(每份血清各用1个
加样嘴),每份血清加两个孔.
每块反应板均需设阳性对照及阴性对照血清.冻干的阴,阳性对照血清,按瓶上标注量加人稀释液
(6.3),溶解后加入上述包被板孔内.阴,阳性对照血清各两孔,每孔100 pL.盖好板盖,置37℃水浴中,
保温1 h,
7.3洗板
甩掉板孔内的血清,向各孔注入洗液,按(7 .1)方法洗三次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打吸干.
7.4加酶标记抗体
按瓶签标注量,用稀释液((6.3)将冻干酶标记抗体溶解混匀后,每孔加100 yL,盖好板盖,置37 C水
浴中,保温1h.
7.5洗板
甩掉板孔内的酶标记抗体,向各孔注入洗液,按((7.1)方法洗三次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打
吸干口
7.6加底物溶液
用100 pL微量吸液器,每孔加新配制的底物溶液100 pL,在室温下避光反应大约5.10 min(见附
录C),
7.7终止反应
用玻璃滴管每孔滴加终止剂1滴.
8结果判定
8.1目测法
阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色,阴性对照血清孔无色或基本无色,被检血清孔凡显色者即判为马
传贫病毒抗体阳性.如遇颜色反应较弱,但与阴性对照血清孔还有差异者,用目测法难以判定时,则以比
色法测定结果为最终结果.
8.2比色法
用酶标测试仪,在波长492 nm下,测定各孔OD值,阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0,阴
性对照血清的两孔平均OD值小于或等于..2为正常反应.按以下两个条件判定结果:被检血清的两孔
平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比,大于或等于2,且被检血清的两孔平均OD值在..2
以上者,判为马传贫病毒抗体阳性,否则为阴性.
GB/''r 17494-1998
附录A
(标准的附录)
马传贫酶标记抗体质t的说明
马传贫酶标记抗体(冻干品),系山羊抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物.对标准阳性血清的平
切终点((PEP)应(0. 25 Ftg/mL,平切滴度((PT)应>- 1:10 240倍.酶标记抗体用二倍平切终点的浓度,
对标准阳性血清与标准阴性血清的1:20倍稀释液进行测定,阳性吸收值应>1. 0,阴性吸收值应
(0. 2.在一20℃下可保存2年.
附录B
(标准的附录)
马传贫病毒抗原包被板质t的说明
马传贫病毒抗原包被板,系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔聚苯乙烯板制备而成,对标准阳性血
清的终点滴度)1:20 480倍.在一20℃下可保存2年.
附录C
(标准的附录)
底物溶液作用时间的说明
底物溶液的作用时间与环境温度有关,如温度较高,酶催化作用就快,颜色反应则快.如温度低,酶
的催化作用就慢,颇色反应则慢.因此底物的作用时间多依阳性和阴性对照血清颜色变化为准.当阳性
对照血清孔呈鲜明的黄色,而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应.标准中规定的底物作用
时间5^10 min,是在不同温度条件下的大致范围.
409137
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·下一篇：青海省慢性非传染性疾病监测点建设规范
前言
马传染性贫血病(简称马传贫,下同)的流行,曾给我国养马业造成巨大的经济损失.经过多年的防
制,在全国范围内取得显著成效,已达到控制标准.为消灭马传贫,提供一个先进有效,特异敏感,反应快
速,操作方便,易于推广的检测方法,是十分必要的.为此制定马传染性贫血病间接ELISA技术规程.
马传贫间接ELISA技术自1983年建立以来,已在全国主要养马省区推广应用十余年之久,在马传
贫防制工作中发挥了重要作用.特别是研制的试剂实现了标准化,商品化,并以低耗优质的产品质量,为
该方法推广应用奠定了基础,在这方面我们已走在世界前列.
本标准的附录A,附录B,附录C都是标准的附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由中华人民共和国农业部畜牧兽医司归口.
本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草.
本标准起草人:戴玉坤.
中华人民共和国国家标准
马传染性贫血病间接ELISA技术规程GB/''f 17494-1998
Rules of indirect ELISA technique
for equine infectious anemia disease
1范围 本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA技术规程的测定原理,仪器设备,试剂,配制溶液,操作
步骤,结果判定.
本标准适用于检测马血清中的马传贫疫毒抗体.可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马
匹的检疫,马传贫病马的定性;也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定.
2引用标准
下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文.本标准出版时,所示版本均
为有效.所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性.
NY 127-1987马传贫酶联免疫吸附试验(ELISA间接法)抗原,酶标记抗体制造及检验试行规
程
3测定原理
用特制的马传贫病毒抗原(NY 127),包被聚苯乙烯微量板孔,使免疫反应在固相载体上进行.当被
检血清中有马传贫病毒抗体存在时,则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物,再与酶标记的抗体(抗马
免疫球蛋白)反应,最后通过测定酶作用底物催化后的产物,进行定性,定量抗体测定.
4仪器设备
吸管:1 mL,5 mL,10 mL;
量桶:50 mL,100 mL,1 000 mL;
烧杯:50 mL,100 mL;
玻璃滴管:每滴体积约20^-30 pL;
血清稀释板:2.孔板每孔容积为1 mL;
定量加液器:1 mL分装定量;
微量吸液器:50 pL,100 pL;
分析天平:感量..001 g;
托盘夭平:感量..01 g;
水浴锅;
酶标测试仪.
5试荆除特别注明外,所用试剂皆为分析纯.
国家质f技术监督局1998一08一31批准1999一01一01实施
GB/''r 17494-1998
磷酸氢二钠;
磷酸二氢钠;
氯化钠;
柠檬酸;
磷苯二胺(化学纯);
过氧化氢(浓度30%);
吐温-20(Tween-20);
白明胶(Gelatin white) (E. Merck);
健康牛血清(无污染);
浓硫酸(纯度95%-98%);
酶标记抗体(冻干品,活性和特异性应符合NY 127,见附录A);
马传贫病毒抗原包被板(活性和特异性应符合NY 127,见附录B);
阴性及阳性对照血清(冻干品,活性和特异应符合NY 127).
6配制溶液
6.1磷酸盐缓冲液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS)
6.1.1 0. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(NaiHPO, 12HzO) 71. 64 g,先加适量的去离子
水加热溶解,最后定容至1 000 mL,混匀.
6.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液:称取磷酸二氢钠(NaH,PO, " 2H,O) 31. 21 g,先加适量的去离子水
加热溶解,最后定容至1 000 mL,混匀.
6.1.3量取..2 mol/L磷酸氢二钠溶液360 mL,0. 2 mol/L磷酸二氢钠溶液140 mL,称取氯化钠
38 g,混在一起,用去离子水溶解稀至5 000 ml-,
6.2洗液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS-0. 05%吐9-20)
量取0. 02 mol/L pH7. 2 PBS 1 000 mL,加入0. 5 mL吐温-20,混匀.
6.3血清及酶标记抗体稀释液(0. 02 mol/L pH7. 2 PBS-0. 05%吐温-20-0.1%白明胶-10%健康牛血
清) 量取洗液((6.2)100 mL,加入100 mg白明胶加热溶解,冷却后量取90 mL,加人健康牛血清10 mL,
混匀.
6.4底物溶液(pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液,内含..04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)
6.4.1 pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液:称取柠檬酸(CsHsO, H20)21.01 g,用去离子水溶解,定容至
1 000 mL.量取243 mL与.. 2 mol/L磷酸氢二钠溶液(6.1.1)257 mL混合,于4℃冰箱中保存不超过
一周.
6.4.2称取40 mg邻苯二胺,溶于100 mL pH5. 0磷酸盐一柠檬酸缓冲液((6.4.1)中(用前从4℃冰箱中
取出,在室温下放置20^-30 min平衡温度),待溶解后,加人150 pL过氧化氢混匀.根据试验所需量按
此比例增减.现用现配,剩余液废弃.
6.5终止剂:2 mol/L硫酸
量取浓硫酸4 mL加入32 mL去离子水中,混匀.
了操作步骤
了.1洗板
去掉抗原包被板的密封条及板孔保护膜,向各孔注入洗液,浸泡约3 min,甩干,再重新注入洗液
重复洗下次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打吸干.
了.2加被检血清及对照血清
GB/T 17494-1998
将被检血清登记编号后,用50 pL微量吸液器依次各取50 pL加人到血清稀释板的各孔内(每份血
清各用1个加样嘴).用定量加液器,将.95 mL的稀释液(6.3)依次加人装有血清的各孔内,使血清做
1120倍稀释.混匀后用100 pL微量吸液器将被检血清依次加人抗原包被板孔内(每份血清各用1个
加样嘴),每份血清加两个孔.
每块反应板均需设阳性对照及阴性对照血清.冻干的阴,阳性对照血清,按瓶上标注量加人稀释液
(6.3),溶解后加入上述包被板孔内.阴,阳性对照血清各两孔,每孔100 pL.盖好板盖,置37℃水浴中,
保温1 h,
7.3洗板
甩掉板孔内的血清,向各孔注入洗液,按(7 .1)方法洗三次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打吸干.
7.4加酶标记抗体
按瓶签标注量,用稀释液((6.3)将冻干酶标记抗体溶解混匀后,每孔加100 yL,盖好板盖,置37 C水
浴中,保温1h.
7.5洗板
甩掉板孔内的酶标记抗体,向各孔注入洗液,按((7.1)方法洗三次,甩净孔内残液,再在滤纸上拍打
吸干口
7.6加底物溶液
用100 pL微量吸液器,每孔加新配制的底物溶液100 pL,在室温下避光反应大约5.10 min(见附
录C),
7.7终止反应
用玻璃滴管每孔滴加终止剂1滴.
8结果判定
8.1目测法
阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色,阴性对照血清孔无色或基本无色,被检血清孔凡显色者即判为马
传贫病毒抗体阳性.如遇颜色反应较弱,但与阴性对照血清孔还有差异者,用目测法难以判定时,则以比
色法测定结果为最终结果.
8.2比色法
用酶标测试仪,在波长492 nm下,测定各孔OD值,阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0,阴
性对照血清的两孔平均OD值小于或等于..2为正常反应.按以下两个条件判定结果:被检血清的两孔
平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比,大于或等于2,且被检血清的两孔平均OD值在..2
以上者,判为马传贫病毒抗体阳性,否则为阴性.
GB/''r 17494-1998
附录A
(标准的附录)
马传贫酶标记抗体质t的说明
马传贫酶标记抗体(冻干品),系山羊抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物.对标准阳性血清的平
切终点((PEP)应(0. 25 Ftg/mL,平切滴度((PT)应>- 1:10 240倍.酶标记抗体用二倍平切终点的浓度,
对标准阳性血清与标准阴性血清的1:20倍稀释液进行测定,阳性吸收值应>1. 0,阴性吸收值应
(0. 2.在一20℃下可保存2年.
附录B
(标准的附录)
马传贫病毒抗原包被板质t的说明
马传贫病毒抗原包被板,系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔聚苯乙烯板制备而成,对标准阳性血
清的终点滴度)1:20 480倍.在一20℃下可保存2年.
附录C
(标准的附录)
底物溶液作用时间的说明
底物溶液的作用时间与环境温度有关,如温度较高,酶催化作用就快,颜色反应则快.如温度低,酶
的催化作用就慢,颇色反应则慢.因此底物的作用时间多依阳性和阴性对照血清颜色变化为准.当阳性
对照血清孔呈鲜明的黄色,而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应.标准中规定的底物作用
时间5^10 min,是在不同温度条件下的大致范围.
409137
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