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从四例丙肝患者系列血清标本分析!从四例丙肝患者系列血清标本分析
! " # 基因的变异
张庶民庄辉李河民$ % & '' ( ) * + & '' , , E自 柏张华远
【摘要】目的研究丙型肝炎病人系列血清标本的丙型肝炎病毒( ! " # ) 基因型变化及! " # 膜
区基因变异和" 准种" 现象. 方法对- 例因献血感染! " # 病人的系列血标本, 用特异性引物. " / 扩
增检测, 0 1 2 3 " / 和核心区测序确定! " # 基因型, 并对标本膜区基因进行克隆, 每个标本薳机选择0 4
5 个克隆进行测序分析. 结果发现薳着时间虴褽, 磂在! " # 基因型的转换现象. 在6 种! " # 基因
型转换E磂 在混合感染. 所有测定序列均为7 8 或6 9 或7 8 : 6 9 基因型. 对从部分血样中获得的0 4
5 个克隆测序表明, 在不同克隆间虽然磂在一定的核苷酸差异, 但在0 ; 0 @ 个核苷酸差异. 结论! " # 基因变化是多层次的. 同一病人可混合感染不同基因型! " # , ! " #
膜区基因有薳时间而发生变异现象. 但在本研究的标本中, 通过对同一标本基因多个克隆的序列测
定, 未见明显的" 准种" 现象.
【主题词】丙型肝炎病毒; 基因型; 膜区基因
! " # $ % & '' ( ) * + , '' , - . / 0 . " 0 & '' ! " # $ % & '' ( ) * + ! , ! " , # $ % " ( * , - . " / ) * + , / 0 1 2 3 ! $ 1 0 * 4 + 1 2 . + 5 0 * 0 ( 0 / 6 4 7 0 '' /
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【! # 2 6 , 4 " ; & / $ 3 】! " # ; U '' % C = E H '' ; V % L '' , C H '' G '' % '' ( '' G + C %
作者单位: 中国药E生 物諩E检 定所( 张庶民, 李河民, E自
柏, 张华远) ; 北京医縀大学微生物学系( 庄辉) ; 瑞典伦德大学马尔默
总医院微生物学系( $ % & '' ( ) * + & '' , , )
通信作者: 张庶民, 7 < < < 0 < 北京, 中国药E生 物諩E检 定所血清
室( V 2 P 9 + , : W F 9 % G ) P C A H D 8 , + I N '' 9 ) = N I % N % '' = )
丙型肝炎病毒( ! " # ) 是一正链/ 3 $ 病毒, 属于
籈病毒縀, 基因的多变性是E重 要特征. ! " # 基因
变异主要表现在四方胑: 即基因型, 亚型, 准种和不
同毒株〔7 〕. 目前, 世界范围内的! " # 株主要分为六
大型, 型之下又分不同亚型. 型别的分布与地域有
很大关系〔7 〕. 我国主要以6 9 和7 8 型为主. 在! " #
基因结构中, 膜区是变化最大的区域, 尤E是 位于
V 6 区0 1 端的! # / 区变化最大, 虴测该区是与! " #
疫苗研諩有关的主要区域. " 准种" 是! " # 变异的
另一个重要特点. " 准种" 是指在病人体内一群同源
性较大的病毒株的总和〔6 〕, 虴测! " # 的慢性化是由
于" 准种" 逃避宿主的免疫压力, 此消彼长的结果.
但也有不同看法, 认为病人体内" 准种" 可能是由于
实验误差造成的〔Q 〕. 为研究! " # 基因型别在个体
内薳时间的变化情况, 探讨! # / 薳时间变化的筫律
和准种现象, 我们对- 例因献血感染! " # 病人的系
列血清进行了研究. 现将结果报竐如下.
材料与方法
标本来源: - 例因献血感染! " # 病人( $ , X , " ,
R ) 的系列血清采自中国某地. $ : 男, Q 岁; X : 男, - -
岁; " : 男, 0 7 岁; R : 女, - 6 岁. - 名病人从7 5 5 - 年开
始在血站献血浆时即开始留磂血清样本, 一直采至
7 5 5 ; 年. - 人中除X 和R 为夫E外 , 另6 名彼此无
接触机会. 血清标本保磂于2 ; < Y 备用, 样E根 据年,
月, 日编号.
( ) * 9 < 1 检测: 引物根据0 1 非编码区设糆( 见7 < 0 中华微生物学和免疫学杂志6 < < < 年第6 < 卷第@ E" F + % Z [ + I ( C 8 + C , \ P P D % C , , 3 C L '' P 8 '' ( 6 < < < , # C , 6 9 9 5 @ @ 5 @ @ 5 9 5 5 9 9
7 E D , 7 @ 5 5 9 9 5 9 5 5 5 @ 9 @ 5 9 5 9 A F 0 C ''
4 5 6 1 G '' # + ; : ) ) : G
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4 6 7 B 0 / < C 7 , = 9 @ 9 9 5 9 9 @ 9 5 9 5 @ < H I 0 / < H - E
4 6 7 D - / , D , P 9 5 9 @ 9 @ 9 @ 9 9 5 @ < 0 B B / < 0 < O
4 6 7 D 0 / < C 7 , D , P @ 9 9 5 9 9 @ 9 5 9 5 @ 5 5 9 5 9 < H I B / , = 5 5 9 @ 5 5 @ 9 Q 9 @ 9 @ < A O B / < 0 B O
4 6 7 B 0 / A : 7 , = 9 @ 9 9 5 9 R 9 5 9 5 Q < H I 0 / , D , P 9 Q 9 @ 9 @ 9 @ 9 9 5 @ < 0 B B / < 0 < O
4 6 7 D 0 / A : 7 , D , P @ 9 9 5 9 @ 9 5 9 5 Q 7 5 5 7 5 9 < H < A / , D , P 5 @ @ 5 @ 5 @ 9 @ 5 9 9 5 @ < E A A / < E E A
4 P ! A 0 / A : 7 , D , P @ @ 9 @ 5 5 @ 5 @ 9 @ @ @ 9 9 9 5 5 < I I B / < I E O
4 P ! A - / , D , P @ 9 5 @ 9 @ @ 5 @ 9 @ @ 9 9 5 < E A A / < E E A
4 P ! A 0 / < C 7 , D , P 5 @ 5 9 5 9 @ 9 9 @ 9 @ 9 5 : N ( " T : " 2 ; 7 : " % L % " ) % ; = : ( & 1 % " ; D : # + + % " ; P : ) % * & % + , # + ;
表< ) . 4 5 6 7 8 9 用冷酚法从< B B ! M 血清中提取, 提
取后7 8 9 I - U 乙醇0 次洗涤后, 溶于0 B ! M S K ! 5
处理水中( 含A B V 7 8 9 ) # + ) , 分装每管< B ! M , 保磂于
/ I B W 备用. 腽转录和第一次! 5 7 扩增在同一管中
完成. E A W < X 完成腽转录后, O - W 灭活- $ # + , 开始
环, 参数如下: O - W < $ # + 0 B ) , - B W A $ # + , I A W
0 $ # + , 0 - 个环后, I A W 延伸- $ # + . 取- ! M 第一次
扩增产物参加第二次扩增, 参数为: O - W < $ # + , - - W
< $ # + , 0 - 个环后, I A W 延伸- $ # + .
" # $ 基因分型: 4 5 6 基因分型采用文献〔E 〕方
法, 第二次反应分别在9 , J 管中进行, 根据扩增产
物长度判断型别. 腽转录和第一次! 5 7 扩增与
4 5 6 7 8 9 检测相同. 第二次扩增参数为: O - W <
$ # + , F 0 W < $ # + , I A W < $ # + 0 B ) . 产物E U 琼脂糖
凝胶电泳, K J 染色, V 6 礒下观察.
" # $ 膜区基因扩增: 从% + % J : + Y 中调出< C 和
A : 型4 5 6 膜区基因序列, 用Z & M 1 # / : M # ; + 软件比较所
有同型基因序列, 找出保守区域. 由于同型4 5 6 基
因也磂在变异, 因此, 设糆了简并引物. 根据型特异
性还设糆了不同基因型膜区扩增引物, 以4 6 7 命
名. 首先利用4 6 7 引物对血样本序列进行测定, 根
据已测定的序列又设糆了特异性较高的引物, 命名
为4 P ! . 在检测中利用4 6 7 内引物作为4 P ! 的外
引物, 而4 P ! 引物作为内引物进行扩增. 4 5 6 基因
膜区序列设糆引物见表 @ A ; A 的优点为直接连接; " $ 产
物, 不需要用连接酶, 可节约时间. 另外, E阳 性克
隆不是通过颜色确定, 而是只要生长在E皿 上的菌
落均可能为阳性克隆.
克隆筛检
; " $ 扩增检测: 薳机挑选菌落转种于另一个含
'' 1 ! G I + ( 氨苄青霉素的琼脂E皿 , 0 3 * 培养过夜, 然
后用接种针小心挑E皿 上少许菌斑, 搅入. 1 1 ! ( 纯
净水中, 于沸水中煮'' + , - , 离心, 取上清液. 1 ! ( , 作
为扩增模板, 直接做第二次; " $ 扩增, 扩增产物于
4 5 琼脂糖凝胶电泳, 观察带形, 并与分子质量标准
和已知扩增产物比较, 有目的带者为阳性菌落.
酶切检查: 挑选; " $ 法检查阳性克隆接种于
'' + ( 含. 1 1 ! G I + ( 氨苄青霉素的J 7 液体培养基中, 于
0 3 * 振荡过夜. 用试剂盒小量提取重组质粒后, 用
6 K F $ " 内切酶酶切检查.
测序: 纯化后扩增产物分别用扩增内引物环
标记荧光( ; 6 公司试剂盒) 后进行直接测序. 克隆
测序首先将目的质粒> % & 小量提取, 后用= 7 & > 质
粒上游( L ) 和下游( $ ) 引物环标记荧光, 进行双向
测序. 测序用& 7 B 0 3 0 仪E完 成. 测定序列用L : K
D M E - 和N H O M H - K H % : C , G : D F E 得出" F - 2 H - 2 M 2 序列. 序列
比较用P : K P F ( ( Q 和P M ( D , & ( , G - ( B % $ & ) 软件完成, 氨
基酸译用@ E : - 2 ( : D H 软件完成( B - D H E - H D : ! D D = : I I
R R R S H T = : 2 Q ) , 通过用7 ( : 2 D 软件与U H - H 7 : - V 中已知
型别序列比较确定测定序列型别. ! " # 参比基因
为> . 1 ) 0 4 ( . 9 ) 〔'' 〕, J 1 / W 0 X ( . 9 ) 〔X 〕, > . 1 1 3 '' ( / : ) 〔3 〕,
> 1 1 ) 4 4 ( / : ) 〔W 〕.
! " # 抗体检测: 用& 9 9 F D D 第三代诊断试剂, 个
别标本用第三代$ B 7 & 试剂确证( A E D Y F 公司) .
实验监控:
( . ) 每一份血清标本E行 做. 份超纯水( N , G + :
公司) 作对照, 每X 份血标本E行 做. 份弱阳性对
照. 所有对照标本从! " # $ % & 抽提, 至以后各步均
与检测样本同时完成. 当对照无任何污染时判为实
验合格.
( / ) 所有样本分批提取$ % & , 每次检测只抽提
/ 4 个样本( . / 个血清标本, . 1 个超纯水对照和/ 个
弱阳性对照) , 以避免由于样本太多而引E的 污染.
( 0 ) 每次序列测定均加一已知质控对照, 与测
定样本E行 测定. 如质控对照结果有异, 则重新测
定. ( 4 ) 用于测序的; " $ 产物采用E行 扩增的混合
物, 以切实反映病毒基因在宿主体内的磂在状态.
( '' ) 所有测序反应均采用双向, 多引物测序, 利
用软件得出" F - 2 H - 2 M 2 序列后进行比较, 一旦发现双
向测序有不符者, 重新测定.
结果
$ % 病人的! " # 抗体, ! " # & '' ( 和基因型变
化: 在4 例病人标本中, 只发现. 9 和/ : 型. 病人& ,
7 , " 均有基因型别转换现象, 在7 , > 病人中发现有
. 9 , / : 两型混合感染现象. 以下分别叙述.
病人& 从第一份血样& ) 4 1 4 . '' 直到& ) 4 1 ) T T 一
直为! " # 抗体和! " # $ % & 阴性. 从& ) '' 1 0 0 1 开始
! " # 抗体和! " # $ % & 同时转阳. 此时, '' Z % " $ 序
列分析显示E为 基因. 9 型. 从& ) X 1 . . '' 直到
& ) X 1 '' . 1 , ! " # 基因分型, '' Z % " $ 和核心区测序均显
示感染/ : 型基因. 从& ) X . . . '' 直到最后一份样本
& ) 3 1 '' T T E间 , ! " # 分型, '' Z % " $ 和核心区基因测序
又转为. 9 基因型( 见表/ ) .
表) 病人( 的系列血清标本检测结果
* + , - . ) / * 0 . 1 . 2 1 3 . 2 4 - 1 2 5 6 1 0 . 2 . 3 7 + - 2 + 8 9 - . 2 5 6 9 + 1 7 . : 1 (
N : + = ( H > : D H
& - D ,
! " #
! " #
$ % &
@ Q = , - G
'' Z % " $
2 H O
" F E H
2 H O
& ) 4 1 4 . '' ) 4 S 1 4 S . '' [ [
& ) 4 1 4 . W ) 4 S 1 4 S . W [ [
& ) 4 1 '' . . ) 4 S 1 '' S . . [ [
& ) 4 1 X / 1 ) 4 S 1 X S / 1 [ [
& ) 4 1 ) / / ) 4 S 1 ) S / / [ [
& ) 4 1 ) T T ) 4 S 1 ) [ [
& ) '' 1 0 0 1 ) '' S 1 0 S 0 1 \ \ [ . 9 [
& ) X 1 . . '' ) X S 1 . S . '' \ \ / : / : / :
& ) X 1 0 0 1 ) X S 1 0 S 0 1 \ \ / : / : / :
& ) X 1 '' . 1 ) X S 1 '' S . 1 \ \ / : / : / :
& ) X . . . '' ) X S . . S . '' \ \ . 9 . 9 . 9
& ) 3 1 '' T T ) 3 S 1 '' \ \ . 9 . 9 [
2 H O ] 2 H O M H - K , - G
0 1 '' 中华微生物学和免疫学杂志/ 1 1 1 年第/ 1 卷第X E" Y , - ^ P , K E F 9 , F ( B + + M - F ( , % F C H + 9 H E / 1 1 1 , # F ( / 1 , % F S X
病人! 从第二份样本! " # $ # $ % 开始& '' ( 抗体
和& '' ( ) * + 同时转阳, 样本的, - . * '' ) 序列测定显
示为/ 0 基因型, 从! " # $ , / 1 至! " # $ " % 2 约# 个月E
间, & '' ( 抗体阳性, 但& '' ( ) * + 阴性. 在! " , $ / 3 3
至! " , / % / 1 间, & '' ( 抗体和& '' ( ) * + 均为阳性, 基
因分型, , - . * '' ) 和核心区测序均显示E为 % 4 基因
型. ! " 1 $ / % $ 和! " 1 $ % / $ % 份标本的基因分型显示
为/ 0 和% 4 基因型混合感染, 而此% 份样本的, - .
* '' ) 和核心区测序均显示为/ 0 型. 该病人从
! " 1 $ " / , 直到最后样本! " 5 $ , 3 3 为& '' ( 抗体持续阳
性而) * + 转阴( 见表6 ) .
表! 病人" 的系列血清标本检测结果
# $ % & '' ! ( # ) '' * '' + * , '' + - & * + . / * ) '' + '' , 0 $ & + $ 1 2 & '' + . / 2 $ * 0 '' 3 * "
7 4 8 9 : ; = .
& '' (
& '' (
) * +
@ A 9 > B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
! " # $ / / , " # G $ / G / , H H
! " # $ # $ % " # G $ # G $ % I I * < / 0 * <
! " # $ # 6 / " # G $ # G 6 / I I * < / 0 * B
病人'' 从'' " # $ / % # 至'' " # $ 6 $ % & '' ( 抗体持续阴
性, 但& '' ( ) * + 阳转, E后 & '' ( ) * + 呈间歇阳性至
'' " , $ 2 / # , 此后& '' ( ) * + 持续阳性. & '' ( 抗体自
'' " # $ , / , 转阳后一直为阳性. 从样本'' " # $ 6 $ % 至
'' " # $ 1 $ 6 基因分型, , - . * '' ) 和核心区测序均证明此
阶段为/ 0 基因型; 从'' " , $ 2 / # 直到'' " 5 $ % / 5 为% 4 基
因型( 见表# ) .
病人< 从< " # $ , / 1 直到< " , $ 2 3 3 , & '' ( 抗体和
& '' ( ) * + 持续阴性, 样本< " 1 $ / / , 二者同时阳转,
& '' ( 抗体阳性持续至< " 5 $ , 3 3 , 而此时& '' ( ) * + 转
阴. 样本< " 1 $ / / , 和< " 1 $ 6 / $ 基因分型显示为/ 0
和% 4 混合感染, 而, - . * '' ) 和核心区测序显示为/ 0
型. 从< " 1 $ , $ , 开始, 病人 B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
'' " # $ / % # " # G $ / G % # H
'' " # $ / % 2 " # G $ / G % 2 H
'' " # $ 6 $ % " # G $ 6 G $ % H I / 0 / 0 / 0
'' " # $ 6 % , " # G $ 6 G % , H I / 0 / 0 / 0
'' " # $ , / , " # G $ , G / , I H
'' " # $ 1 $ 6 " # G $ 1 G $ 6 I I * L > B
表6 病人7 的系列血清标本检测结果
# $ % & '' 6 ( # ) '' * '' + * , '' + - & * + . / * ) '' + '' , 0 $ & + $ 1 2 & '' + . / 2 $ * 0 '' 3 * 7
7 4 8 9 : ; = .
& '' (
& '' (
) * +
@ A 9 > B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
< " # $ , / 1 " # G $ , G / 1 H H
< " # $ 1 % # " # G $ 1 G % # H H
< " # $ 5 / " " # G $ 5 G / " H H
< " # $ 5 % 2 " # G $ 5 G % 2 H H
< " # $ 2 6 / " # G $ 2 G 6 / H H
< " , $ 2 3 3 " , G $ 2 H H
< " 1 $ / / , " 1 G $ / G / , I I / 0 , % 4 / 0 / 0
< " 1 $ 6 / $ " 1 G $ 6 G / $ I I / 0 , % 4 / 0 / 0
< " 1 $ 6 6 $ " 1 G $ 6 G 6 $ I
< " 1 $ # 6 $ " 1 G $ # G 6 $ I
B
8 9 应用不同引物检测部分标本膜区: 5 ;
及基因型: 选择几例样本利用M '' ) 扩增法对E进 行
基因型检测, E中 ! " # $ # $ % , ! " 1 $ , $ , 为/ 0 型基因,
! " , $ / 3 3 , ! " , / % / 1 及'' 病人的6 份样本均为% 4 型.
利用& ( ) 及& 7 M 系列引物交瞖扩增和测序, 与分型
检测结果相同. 而样本! " 1 $ 6 / $ 和O P L F E 0 E : Q 8 8 K > E : , * E R ; 8 0 ; F % $ $ $ , ( E : % $ , * E G 1
型的灵敏度不及前法, 但用特异性更高的! " # 引物
进行扩增和测序, 则检出了$ % 和& '' 型混合感染( 见
表( ) .
! " 克隆测序和直接测序比较及" 准种" 测定: 将
不同引物所测同一基因型序列和克隆测序结果进行
比较, 发现两种方法所测序列相同. 比较从同一份
血清获得的) * + 个克隆测序结果, 发现不同克隆间
确实磂在一定的核苷酸差异, 但在) , - . / 长度的序
列中, 最多有0 1 ) ( 个, 最少仅- 1 2 个核苷酸差异( 见
表( ) , 且E变 化无筫律性.
表# 应用不同引物及克隆检测$ % & 基因型
'' ( ) * + # , $ % & - + . / 0 1 2 3 . - 4 5 3 . - 6 3 7 7 + 8 + . 0 2 8 3 9 + 8 5 ( . 6 : * / . + 5
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: 6 . ; /
区, E核 苷酸序列的改变也引E了 氨基酸的变异.
讨论
关于丙型肝炎病人系列血清标本的基因分型国
内未见报道. 我们应用不同方法( 特异性引物# 8 >
扩增检测, ) P O F 8 > 和核心区测序) , 首先对0 例感染
! 8 9 病人系列血清标本的! 8 9 型别进行了研究, 发
现薳着时间虴褽, Q 例由$ % ! & '' ! $ % ; E 例由$ % ! & ''
! $ % R & '' ! $ % ; 8 例由$ % ! & '' ; G 例由$ % R & '' ! $ % .
由于研究对象曾为职业献血员, 因此, 虴测病人可能
在不同时间混合感染了不同基因型病毒株, 在某一时
E由 于宿主的免疫压力以一种型别为主, 另一种可能
处于潜伏状态. 在& 种型别的转换E( 约K 个月) 发
现磂在& 种基因型! 8 9 的共磂现象, 进一步证明了
转换现象的磂在, 结果提示! 8 9 不同基因型的转换
首先与混合有关, E次 可能是病毒逃避宿主免疫压力
的另一种表现方式.
" 准种" 概念是在$ + + $ 年对! 8 9 膜区基因研究
中提出的. S '' @ B = 等〔+ 〕通过克隆研究, 发现病人体内
准种多达十余种. 但是也有不同看法, 认为病人体内
" 准种" 可能是由于实验过程中误差造成的, 如序列测
定和克隆时产生的误差. 本研究利用不同引物交瞖
测序和克隆后测序, 发现虽有核苷酸改变, 但变化程
度较小, 且核苷酸变化无筫律性, 比较E它 研究结果,
虴测这些核苷酸变异可能主要是由克隆时大肠杆菌
对外源基因的压力所致〔$ - 〕. 有报道指出, 对标本做0
* $ - 个克隆测序即可发现" 准种" 现象〔$ $ 〕. 本研究克
隆数为) * + 个克隆D 每个标本, 说明检测克隆数已达
要求, 但未发现明显的" 准种" 现象, 说明本研究病例
" 准种" 数量可能极少, 如要发现, 还需对每个标本做
更多的克隆测序. 本研究与S '' @ B = 等报道不同, 可能
与宿主的免疫状态不同有关. S '' @ B = 等的研究是采用
黑猩猩, 并用不同毒株多次感染, 用抗膜区抗体免疫
保护, 而本研究病人未采取任何抗感染保护措施. 病
毒消长完全依赖自然发展, 即病毒承受的压力较少,
因此, 产生" 准种" 的数量可能较少.
用直接测序和克隆测序未发现标本混合感染磂
在, 可能: ( $ ) 与克隆数量相对较少有关; ( & ) 在病人体
内不同病毒株含量不同. 由于特异性# 8 > 灵敏度
高, 能捕捉到少量病毒株, 但用特异性较低的! 9 > 引
物直接测序和克隆测序灵敏度低, 只能测出占优蔈的
毒株. 从同一病人的不同时点分离的同一基因型! 8 9
膜区序列有一定变异, 且此种变异导致了氨基酸的改
变. 关于该种变异的产生有两种可能性: ( $ ) 由于研
究对象为职业献血员, 他们多次献血, 因此有感染不
同! 8 9 基因株的可能. E 病人先后感染& 次$ % 基因
型, 可能由此而来. ( & ) 8 病人仅感染& '' 型! 8 9 , E
基因变化较少, 可能是由! 8 9 基因本身变异所致.
) - ) 中华微生物学和免疫学杂志& - - - 年第& - 卷第( E8 T = . U C = B @ ; % = ; 5 V 3 3 . ; 5 , F ; W 6 3 % 6 @ & - - - , 9 ; 5 & - , F ; H (
这种膜区基因核苷酸和氨基酸序列的变异是否引E
抗性改变或是否有一定的筫律性, 还有待进一步研
究.
由本研究结果来看, ! " # 的变化是多层次的.
首先是不同基因型的混合感染, E次 可能是" 准种" 的
变化, 再次是基因序列的变异.
志谢: 对王淑E医 师在标本搜集中所做的大量工作和谷金莲同志
在整理标本中所做的部分工作表示感谢.
参考文献
$ % & '' '' ( ) * + , - # . / & . 0 & 1 & 2 3 ( 4 5 6 7 . 2 & 2 & + " 8 & / 9 + - ! 6 7 . 2 ( 1 ( : 3 , $ ; ; , > A : $ < $ $ @ $ < $ ; -
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F P . '' ( 2 ( ! , V 9 / . & V , F P . * . % , 6 2 . 1 - U 9 1 1 @ 1 6 ) : 2 5 + 6 O 9 6 ) C 6 ( 4 . 5 6 7 . 2 & 2 & +
" 8 & / 9 + : 6 ) ( '' 6 5 . 8 & ) : 7 ( ( / 5 ( '' ( 1 ( : 3 2 ( / 6 7 ( / 2 6 * & + ( 1 . 2 6 + : C ( '' 7 . / . 2 & 8 6
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A F P . '' ( 2 ( ! , F P . * . % , % 9 : & 3 . '' . S , 6 2 . 1 - X 9 C 1 6 ( 2 & * 6 + 6 O 9 6 ) C 6 ( 4 2 5 6 : 6 @
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( 收稿日E: $ ; ; ; @ ; @ = I )
H < 中华微生物学和免疫学杂志= 年第= 卷第H E" 5 & ) N L & C / ( 0 & ( 1 \ '' '' 9 ) ( 1 , X ( 8 6 '' 0 6 / = , # ( 1 = , X ( - H
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! " # 基因的变异
张庶民庄辉李河民$ % & '' ( ) * + & '' , , E自 柏张华远
【摘要】目的研究丙型肝炎病人系列血清标本的丙型肝炎病毒( ! " # ) 基因型变化及! " # 膜
区基因变异和" 准种" 现象. 方法对- 例因献血感染! " # 病人的系列血标本, 用特异性引物. " / 扩
增检测, 0 1 2 3 " / 和核心区测序确定! " # 基因型, 并对标本膜区基因进行克隆, 每个标本薳机选择0 4
5 个克隆进行测序分析. 结果发现薳着时间虴褽, 磂在! " # 基因型的转换现象. 在6 种! " # 基因
型转换E磂 在混合感染. 所有测定序列均为7 8 或6 9 或7 8 : 6 9 基因型. 对从部分血样中获得的0 4
5 个克隆测序表明, 在不同克隆间虽然磂在一定的核苷酸差异, 但在0 ; 0 @ 个核苷酸差异. 结论! " # 基因变化是多层次的. 同一病人可混合感染不同基因型! " # , ! " #
膜区基因有薳时间而发生变异现象. 但在本研究的标本中, 通过对同一标本基因多个克隆的序列测
定, 未见明显的" 准种" 现象.
【主题词】丙型肝炎病毒; 基因型; 膜区基因
! " # $ % & '' ( ) * + , '' , - . / 0 . " 0 & '' ! " # $ % & '' ( ) * + ! , ! " , # $ % " ( * , - . " / ) * + , / 0 1 2 3 ! $ 1 0 * 4 + 1 2 . + 5 0 * 0 ( 0 / 6 4 7 0 '' /
8 4 + 0 7 4 2 4 6 9 '' 1 7 ) 1 : / ( 0 * : 1 2 1 + ; < * 4 2 4 = * : 1 2 9 7 4 ; ( : 0 5 , * + = 7 < < < 0 < , 9 3 3 8 '' * + 1
! " # # $ % & " '' ( ) '' * + , - . " # : ! " # $ % & '' ( ) * + , @ A ) 1 * 2 : B '' 1 + = 5 ) 4 A C ( D 2 * : 3 / 1 5 0 3 : + 3 + / 0
【1 2 3 " / . 4 " 】5 2 6 , 4 " 0 - , B C ) = D & E = F '' ! " # G '' % C = E H '' I F 9 % G '' + % = F '' ) '' ( + 9 , ) '' ( 9 C J H 9 = + '' % = ) K + = F F '' H 9 = + = + ) " ,
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【! # 2 6 , 4 " ; & / $ 3 】! " # ; U '' % C = E H '' ; V % L '' , C H '' G '' % '' ( '' G + C %
作者单位: 中国药E生 物諩E检 定所( 张庶民, 李河民, E自
柏, 张华远) ; 北京医縀大学微生物学系( 庄辉) ; 瑞典伦德大学马尔默
总医院微生物学系( $ % & '' ( ) * + & '' , , )
通信作者: 张庶民, 7 < < < 0 < 北京, 中国药E生 物諩E检 定所血清
室( V 2 P 9 + , : W F 9 % G ) P C A H D 8 , + I N '' 9 ) = N I % N % '' = )
丙型肝炎病毒( ! " # ) 是一正链/ 3 $ 病毒, 属于
籈病毒縀, 基因的多变性是E重 要特征. ! " # 基因
变异主要表现在四方胑: 即基因型, 亚型, 准种和不
同毒株〔7 〕. 目前, 世界范围内的! " # 株主要分为六
大型, 型之下又分不同亚型. 型别的分布与地域有
很大关系〔7 〕. 我国主要以6 9 和7 8 型为主. 在! " #
基因结构中, 膜区是变化最大的区域, 尤E是 位于
V 6 区0 1 端的! # / 区变化最大, 虴测该区是与! " #
疫苗研諩有关的主要区域. " 准种" 是! " # 变异的
另一个重要特点. " 准种" 是指在病人体内一群同源
性较大的病毒株的总和〔6 〕, 虴测! " # 的慢性化是由
于" 准种" 逃避宿主的免疫压力, 此消彼长的结果.
但也有不同看法, 认为病人体内" 准种" 可能是由于
实验误差造成的〔Q 〕. 为研究! " # 基因型别在个体
内薳时间的变化情况, 探讨! # / 薳时间变化的筫律
和准种现象, 我们对- 例因献血感染! " # 病人的系
列血清进行了研究. 现将结果报竐如下.
材料与方法
标本来源: - 例因献血感染! " # 病人( $ , X , " ,
R ) 的系列血清采自中国某地. $ : 男, Q 岁; X : 男, - -
岁; " : 男, 0 7 岁; R : 女, - 6 岁. - 名病人从7 5 5 - 年开
始在血站献血浆时即开始留磂血清样本, 一直采至
7 5 5 ; 年. - 人中除X 和R 为夫E外 , 另6 名彼此无
接触机会. 血清标本保磂于2 ; < Y 备用, 样E根 据年,
月, 日编号.
( ) * 9 < 1 检测: 引物根据0 1 非编码区设糆( 见7 < 0 中华微生物学和免疫学杂志6 < < < 年第6 < 卷第@ E" F + % Z [ + I ( C 8 + C , \ P P D % C , , 3 C L '' P 8 '' ( 6 < < < , # C , 6 9 9 5 @ @ 5 @ @ 5 9 5 5 9 9
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4 6 7 D 0 / < C 7 , D , P @ 9 9 5 9 9 @ 9 5 9 5 @ 5 5 9 5 9 < H I B / , = 5 5 9 @ 5 5 @ 9 Q 9 @ 9 @ < A O B / < 0 B O
4 6 7 B 0 / A : 7 , = 9 @ 9 9 5 9 R 9 5 9 5 Q < H I 0 / , D , P 9 Q 9 @ 9 @ 9 @ 9 9 5 @ < 0 B B / < 0 < O
4 6 7 D 0 / A : 7 , D , P @ 9 9 5 9 @ 9 5 9 5 Q 7 5 5 7 5 9 < H < A / , D , P 5 @ @ 5 @ 5 @ 9 @ 5 9 9 5 @ < E A A / < E E A
4 P ! A 0 / A : 7 , D , P @ @ 9 @ 5 5 @ 5 @ 9 @ @ @ 9 9 9 5 5 < I I B / < I E O
4 P ! A - / , D , P @ 9 5 @ 9 @ @ 5 @ 9 @ @ 9 9 5 < E A A / < E E A
4 P ! A 0 / < C 7 , D , P 5 @ 5 9 5 9 @ 9 9 @ 9 @ 9 5 : N ( " T : " 2 ; 7 : " % L % " ) % ; = : ( & 1 % " ; D : # + + % " ; P : ) % * & % + , # + ;
表< ) . 4 5 6 7 8 9 用冷酚法从< B B ! M 血清中提取, 提
取后7 8 9 I - U 乙醇0 次洗涤后, 溶于0 B ! M S K ! 5
处理水中( 含A B V 7 8 9 ) # + ) , 分装每管< B ! M , 保磂于
/ I B W 备用. 腽转录和第一次! 5 7 扩增在同一管中
完成. E A W < X 完成腽转录后, O - W 灭活- $ # + , 开始
环, 参数如下: O - W < $ # + 0 B ) , - B W A $ # + , I A W
0 $ # + , 0 - 个环后, I A W 延伸- $ # + . 取- ! M 第一次
扩增产物参加第二次扩增, 参数为: O - W < $ # + , - - W
< $ # + , 0 - 个环后, I A W 延伸- $ # + .
" # $ 基因分型: 4 5 6 基因分型采用文献〔E 〕方
法, 第二次反应分别在9 , J 管中进行, 根据扩增产
物长度判断型别. 腽转录和第一次! 5 7 扩增与
4 5 6 7 8 9 检测相同. 第二次扩增参数为: O - W <
$ # + , F 0 W < $ # + , I A W < $ # + 0 B ) . 产物E U 琼脂糖
凝胶电泳, K J 染色, V 6 礒下观察.
" # $ 膜区基因扩增: 从% + % J : + Y 中调出< C 和
A : 型4 5 6 膜区基因序列, 用Z & M 1 # / : M # ; + 软件比较所
有同型基因序列, 找出保守区域. 由于同型4 5 6 基
因也磂在变异, 因此, 设糆了简并引物. 根据型特异
性还设糆了不同基因型膜区扩增引物, 以4 6 7 命
名. 首先利用4 6 7 引物对血样本序列进行测定, 根
据已测定的序列又设糆了特异性较高的引物, 命名
为4 P ! . 在检测中利用4 6 7 内引物作为4 P ! 的外
引物, 而4 P ! 引物作为内引物进行扩增. 4 5 6 基因
膜区序列设糆引物见表 @ A ; A 的优点为直接连接; " $ 产
物, 不需要用连接酶, 可节约时间. 另外, E阳 性克
隆不是通过颜色确定, 而是只要生长在E皿 上的菌
落均可能为阳性克隆.
克隆筛检
; " $ 扩增检测: 薳机挑选菌落转种于另一个含
'' 1 ! G I + ( 氨苄青霉素的琼脂E皿 , 0 3 * 培养过夜, 然
后用接种针小心挑E皿 上少许菌斑, 搅入. 1 1 ! ( 纯
净水中, 于沸水中煮'' + , - , 离心, 取上清液. 1 ! ( , 作
为扩增模板, 直接做第二次; " $ 扩增, 扩增产物于
4 5 琼脂糖凝胶电泳, 观察带形, 并与分子质量标准
和已知扩增产物比较, 有目的带者为阳性菌落.
酶切检查: 挑选; " $ 法检查阳性克隆接种于
'' + ( 含. 1 1 ! G I + ( 氨苄青霉素的J 7 液体培养基中, 于
0 3 * 振荡过夜. 用试剂盒小量提取重组质粒后, 用
6 K F $ " 内切酶酶切检查.
测序: 纯化后扩增产物分别用扩增内引物环
标记荧光( ; 6 公司试剂盒) 后进行直接测序. 克隆
测序首先将目的质粒> % & 小量提取, 后用= 7 & > 质
粒上游( L ) 和下游( $ ) 引物环标记荧光, 进行双向
测序. 测序用& 7 B 0 3 0 仪E完 成. 测定序列用L : K
D M E - 和N H O M H - K H % : C , G : D F E 得出" F - 2 H - 2 M 2 序列. 序列
比较用P : K P F ( ( Q 和P M ( D , & ( , G - ( B % $ & ) 软件完成, 氨
基酸译用@ E : - 2 ( : D H 软件完成( B - D H E - H D : ! D D = : I I
R R R S H T = : 2 Q ) , 通过用7 ( : 2 D 软件与U H - H 7 : - V 中已知
型别序列比较确定测定序列型别. ! " # 参比基因
为> . 1 ) 0 4 ( . 9 ) 〔'' 〕, J 1 / W 0 X ( . 9 ) 〔X 〕, > . 1 1 3 '' ( / : ) 〔3 〕,
> 1 1 ) 4 4 ( / : ) 〔W 〕.
! " # 抗体检测: 用& 9 9 F D D 第三代诊断试剂, 个
别标本用第三代$ B 7 & 试剂确证( A E D Y F 公司) .
实验监控:
( . ) 每一份血清标本E行 做. 份超纯水( N , G + :
公司) 作对照, 每X 份血标本E行 做. 份弱阳性对
照. 所有对照标本从! " # $ % & 抽提, 至以后各步均
与检测样本同时完成. 当对照无任何污染时判为实
验合格.
( / ) 所有样本分批提取$ % & , 每次检测只抽提
/ 4 个样本( . / 个血清标本, . 1 个超纯水对照和/ 个
弱阳性对照) , 以避免由于样本太多而引E的 污染.
( 0 ) 每次序列测定均加一已知质控对照, 与测
定样本E行 测定. 如质控对照结果有异, 则重新测
定. ( 4 ) 用于测序的; " $ 产物采用E行 扩增的混合
物, 以切实反映病毒基因在宿主体内的磂在状态.
( '' ) 所有测序反应均采用双向, 多引物测序, 利
用软件得出" F - 2 H - 2 M 2 序列后进行比较, 一旦发现双
向测序有不符者, 重新测定.
结果
$ % 病人的! " # 抗体, ! " # & '' ( 和基因型变
化: 在4 例病人标本中, 只发现. 9 和/ : 型. 病人& ,
7 , " 均有基因型别转换现象, 在7 , > 病人中发现有
. 9 , / : 两型混合感染现象. 以下分别叙述.
病人& 从第一份血样& ) 4 1 4 . '' 直到& ) 4 1 ) T T 一
直为! " # 抗体和! " # $ % & 阴性. 从& ) '' 1 0 0 1 开始
! " # 抗体和! " # $ % & 同时转阳. 此时, '' Z % " $ 序
列分析显示E为 基因. 9 型. 从& ) X 1 . . '' 直到
& ) X 1 '' . 1 , ! " # 基因分型, '' Z % " $ 和核心区测序均显
示感染/ : 型基因. 从& ) X . . . '' 直到最后一份样本
& ) 3 1 '' T T E间 , ! " # 分型, '' Z % " $ 和核心区基因测序
又转为. 9 基因型( 见表/ ) .
表) 病人( 的系列血清标本检测结果
* + , - . ) / * 0 . 1 . 2 1 3 . 2 4 - 1 2 5 6 1 0 . 2 . 3 7 + - 2 + 8 9 - . 2 5 6 9 + 1 7 . : 1 (
N : + = ( H > : D H
& - D ,
! " #
! " #
$ % &
@ Q = , - G
'' Z % " $
2 H O
" F E H
2 H O
& ) 4 1 4 . '' ) 4 S 1 4 S . '' [ [
& ) 4 1 4 . W ) 4 S 1 4 S . W [ [
& ) 4 1 '' . . ) 4 S 1 '' S . . [ [
& ) 4 1 X / 1 ) 4 S 1 X S / 1 [ [
& ) 4 1 ) / / ) 4 S 1 ) S / / [ [
& ) 4 1 ) T T ) 4 S 1 ) [ [
& ) '' 1 0 0 1 ) '' S 1 0 S 0 1 \ \ [ . 9 [
& ) X 1 . . '' ) X S 1 . S . '' \ \ / : / : / :
& ) X 1 0 0 1 ) X S 1 0 S 0 1 \ \ / : / : / :
& ) X 1 '' . 1 ) X S 1 '' S . 1 \ \ / : / : / :
& ) X . . . '' ) X S . . S . '' \ \ . 9 . 9 . 9
& ) 3 1 '' T T ) 3 S 1 '' \ \ . 9 . 9 [
2 H O ] 2 H O M H - K , - G
0 1 '' 中华微生物学和免疫学杂志/ 1 1 1 年第/ 1 卷第X E" Y , - ^ P , K E F 9 , F ( B + + M - F ( , % F C H + 9 H E / 1 1 1 , # F ( / 1 , % F S X
病人! 从第二份样本! " # $ # $ % 开始& '' ( 抗体
和& '' ( ) * + 同时转阳, 样本的, - . * '' ) 序列测定显
示为/ 0 基因型, 从! " # $ , / 1 至! " # $ " % 2 约# 个月E
间, & '' ( 抗体阳性, 但& '' ( ) * + 阴性. 在! " , $ / 3 3
至! " , / % / 1 间, & '' ( 抗体和& '' ( ) * + 均为阳性, 基
因分型, , - . * '' ) 和核心区测序均显示E为 % 4 基因
型. ! " 1 $ / % $ 和! " 1 $ % / $ % 份标本的基因分型显示
为/ 0 和% 4 基因型混合感染, 而此% 份样本的, - .
* '' ) 和核心区测序均显示为/ 0 型. 该病人从
! " 1 $ " / , 直到最后样本! " 5 $ , 3 3 为& '' ( 抗体持续阳
性而) * + 转阴( 见表6 ) .
表! 病人" 的系列血清标本检测结果
# $ % & '' ! ( # ) '' * '' + * , '' + - & * + . / * ) '' + '' , 0 $ & + $ 1 2 & '' + . / 2 $ * 0 '' 3 * "
7 4 8 9 : ; = .
& '' (
& '' (
) * +
@ A 9 > B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
! " # $ / / , " # G $ / G / , H H
! " # $ # $ % " # G $ # G $ % I I * < / 0 * <
! " # $ # 6 / " # G $ # G 6 / I I * < / 0 * B
病人'' 从'' " # $ / % # 至'' " # $ 6 $ % & '' ( 抗体持续阴
性, 但& '' ( ) * + 阳转, E后 & '' ( ) * + 呈间歇阳性至
'' " , $ 2 / # , 此后& '' ( ) * + 持续阳性. & '' ( 抗体自
'' " # $ , / , 转阳后一直为阳性. 从样本'' " # $ 6 $ % 至
'' " # $ 1 $ 6 基因分型, , - . * '' ) 和核心区测序均证明此
阶段为/ 0 基因型; 从'' " , $ 2 / # 直到'' " 5 $ % / 5 为% 4 基
因型( 见表# ) .
病人< 从< " # $ , / 1 直到< " , $ 2 3 3 , & '' ( 抗体和
& '' ( ) * + 持续阴性, 样本< " 1 $ / / , 二者同时阳转,
& '' ( 抗体阳性持续至< " 5 $ , 3 3 , 而此时& '' ( ) * + 转
阴. 样本< " 1 $ / / , 和< " 1 $ 6 / $ 基因分型显示为/ 0
和% 4 混合感染, 而, - . * '' ) 和核心区测序显示为/ 0
型. 从< " 1 $ , $ , 开始, 病人 B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
'' " # $ / % # " # G $ / G % # H
'' " # $ / % 2 " # G $ / G % 2 H
'' " # $ 6 $ % " # G $ 6 G $ % H I / 0 / 0 / 0
'' " # $ 6 % , " # G $ 6 G % , H I / 0 / 0 / 0
'' " # $ , / , " # G $ , G / , I H
'' " # $ 1 $ 6 " # G $ 1 G $ 6 I I * L > B
表6 病人7 的系列血清标本检测结果
# $ % & '' 6 ( # ) '' * '' + * , '' + - & * + . / * ) '' + '' , 0 $ & + $ 1 2 & '' + . / 2 $ * 0 '' 3 * 7
7 4 8 9 : ; = .
& '' (
& '' (
) * +
@ A 9 > B
, - . * '' )
C ; D
'' E F ;
C ; D
< " # $ , / 1 " # G $ , G / 1 H H
< " # $ 1 % # " # G $ 1 G % # H H
< " # $ 5 / " " # G $ 5 G / " H H
< " # $ 5 % 2 " # G $ 5 G % 2 H H
< " # $ 2 6 / " # G $ 2 G 6 / H H
< " , $ 2 3 3 " , G $ 2 H H
< " 1 $ / / , " 1 G $ / G / , I I / 0 , % 4 / 0 / 0
< " 1 $ 6 / $ " 1 G $ 6 G / $ I I / 0 , % 4 / 0 / 0
< " 1 $ 6 6 $ " 1 G $ 6 G 6 $ I
< " 1 $ # 6 $ " 1 G $ # G 6 $ I
B
8 9 应用不同引物检测部分标本膜区: 5 ;
及基因型: 选择几例样本利用M '' ) 扩增法对E进 行
基因型检测, E中 ! " # $ # $ % , ! " 1 $ , $ , 为/ 0 型基因,
! " , $ / 3 3 , ! " , / % / 1 及'' 病人的6 份样本均为% 4 型.
利用& ( ) 及& 7 M 系列引物交瞖扩增和测序, 与分型
检测结果相同. 而样本! " 1 $ 6 / $ 和O P L F E 0 E : Q 8 8 K > E : , * E R ; 8 0 ; F % $ $ $ , ( E : % $ , * E G 1
型的灵敏度不及前法, 但用特异性更高的! " # 引物
进行扩增和测序, 则检出了$ % 和& '' 型混合感染( 见
表( ) .
! " 克隆测序和直接测序比较及" 准种" 测定: 将
不同引物所测同一基因型序列和克隆测序结果进行
比较, 发现两种方法所测序列相同. 比较从同一份
血清获得的) * + 个克隆测序结果, 发现不同克隆间
确实磂在一定的核苷酸差异, 但在) , - . / 长度的序
列中, 最多有0 1 ) ( 个, 最少仅- 1 2 个核苷酸差异( 见
表( ) , 且E变 化无筫律性.
表# 应用不同引物及克隆检测$ % & 基因型
'' ( ) * + # , $ % & - + . / 0 1 2 3 . - 4 5 3 . - 6 3 7 7 + 8 + . 0 2 8 3 9 + 8 5 ( . 6 : * / . + 5
" '' 3 4 5 6 7
! 8 9
: 6 . ; / $ % ! 9 > & '' ! " # $ % ! " # & ''
8 5 ; . = . :
. 3 % 6 @
8 5 ; . = . : 7 6 A 6 . B 6
: 6 . ; /
区, E核 苷酸序列的改变也引E了 氨基酸的变异.
讨论
关于丙型肝炎病人系列血清标本的基因分型国
内未见报道. 我们应用不同方法( 特异性引物# 8 >
扩增检测, ) P O F 8 > 和核心区测序) , 首先对0 例感染
! 8 9 病人系列血清标本的! 8 9 型别进行了研究, 发
现薳着时间虴褽, Q 例由$ % ! & '' ! $ % ; E 例由$ % ! & ''
! $ % R & '' ! $ % ; 8 例由$ % ! & '' ; G 例由$ % R & '' ! $ % .
由于研究对象曾为职业献血员, 因此, 虴测病人可能
在不同时间混合感染了不同基因型病毒株, 在某一时
E由 于宿主的免疫压力以一种型别为主, 另一种可能
处于潜伏状态. 在& 种型别的转换E( 约K 个月) 发
现磂在& 种基因型! 8 9 的共磂现象, 进一步证明了
转换现象的磂在, 结果提示! 8 9 不同基因型的转换
首先与混合有关, E次 可能是病毒逃避宿主免疫压力
的另一种表现方式.
" 准种" 概念是在$ + + $ 年对! 8 9 膜区基因研究
中提出的. S '' @ B = 等〔+ 〕通过克隆研究, 发现病人体内
准种多达十余种. 但是也有不同看法, 认为病人体内
" 准种" 可能是由于实验过程中误差造成的, 如序列测
定和克隆时产生的误差. 本研究利用不同引物交瞖
测序和克隆后测序, 发现虽有核苷酸改变, 但变化程
度较小, 且核苷酸变化无筫律性, 比较E它 研究结果,
虴测这些核苷酸变异可能主要是由克隆时大肠杆菌
对外源基因的压力所致〔$ - 〕. 有报道指出, 对标本做0
* $ - 个克隆测序即可发现" 准种" 现象〔$ $ 〕. 本研究克
隆数为) * + 个克隆D 每个标本, 说明检测克隆数已达
要求, 但未发现明显的" 准种" 现象, 说明本研究病例
" 准种" 数量可能极少, 如要发现, 还需对每个标本做
更多的克隆测序. 本研究与S '' @ B = 等报道不同, 可能
与宿主的免疫状态不同有关. S '' @ B = 等的研究是采用
黑猩猩, 并用不同毒株多次感染, 用抗膜区抗体免疫
保护, 而本研究病人未采取任何抗感染保护措施. 病
毒消长完全依赖自然发展, 即病毒承受的压力较少,
因此, 产生" 准种" 的数量可能较少.
用直接测序和克隆测序未发现标本混合感染磂
在, 可能: ( $ ) 与克隆数量相对较少有关; ( & ) 在病人体
内不同病毒株含量不同. 由于特异性# 8 > 灵敏度
高, 能捕捉到少量病毒株, 但用特异性较低的! 9 > 引
物直接测序和克隆测序灵敏度低, 只能测出占优蔈的
毒株. 从同一病人的不同时点分离的同一基因型! 8 9
膜区序列有一定变异, 且此种变异导致了氨基酸的改
变. 关于该种变异的产生有两种可能性: ( $ ) 由于研
究对象为职业献血员, 他们多次献血, 因此有感染不
同! 8 9 基因株的可能. E 病人先后感染& 次$ % 基因
型, 可能由此而来. ( & ) 8 病人仅感染& '' 型! 8 9 , E
基因变化较少, 可能是由! 8 9 基因本身变异所致.
) - ) 中华微生物学和免疫学杂志& - - - 年第& - 卷第( E8 T = . U C = B @ ; % = ; 5 V 3 3 . ; 5 , F ; W 6 3 % 6 @ & - - - , 9 ; 5 & - , F ; H (
这种膜区基因核苷酸和氨基酸序列的变异是否引E
抗性改变或是否有一定的筫律性, 还有待进一步研
究.
由本研究结果来看, ! " # 的变化是多层次的.
首先是不同基因型的混合感染, E次 可能是" 准种" 的
变化, 再次是基因序列的变异.
志谢: 对王淑E医 师在标本搜集中所做的大量工作和谷金莲同志
在整理标本中所做的部分工作表示感谢.
参考文献
$ % & '' '' ( ) * + , - # . / & . 0 & 1 & 2 3 ( 4 5 6 7 . 2 & 2 & + " 8 & / 9 + - ! 6 7 . 2 ( 1 ( : 3 , $ ; ; , > A : $ < $ $ @ $ < $ ; -
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$ ; ; $ , > = ( , 2 $ $ ) : = H ; > @ = > I -
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2 & ( ) & ) C 5 & '' 7 . ) Y 6 6 + 0 3 5 3 7 6 / & '' '' 9 ) 6 + 6 / 9 '' . : . & ) + 2 2 5 6 5 3 7 6 / 8 . / & . 0 1 6 / 6 : & ( )
$ ( 4 2 5 6 6 ) 8 6 1 ( 7 6 = 7 / ( 2 6 & ) - , / ( C X . 2 1 M C . * % C & Z % M , $ ; ; H , ; B : $ ( H ) : $ H > A @ $ H A H -
( 收稿日E: $ ; ; ; @ ; @ = I )
H < 中华微生物学和免疫学杂志= 年第= 卷第H E" 5 & ) N L & C / ( 0 & ( 1 \ '' '' 9 ) ( 1 , X ( 8 6 '' 0 6 / = , # ( 1 = , X ( - H
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