GBT%2018638-2002%20%20%20流行性乙型脑炎诊断技术%20
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GBT%2018638-2002%20%20%20流行性乙型脑炎诊断技术%20CB/''r 18638-- 2002
前台
流行性乙1q''j脑炎又称日本乙型脑炎((Japanese B encephalitic),是山流行性乙NUR炎病毒引起的一
种蚊媒性人兽共患传染病成年动物和人常呈隐性感染,幼龄动物特别是马感染后,可发生脑炎症状.妊
娠母猪可引起流产,死胎及木乃伊胎,公猪翠丸肿大,儿童可发生严重的脑炎.多发生于7- 9月份.我
国许多省(Ili )都有本病发生,特别是六t -f年代,发病率最高.对人畜的健康可造成严重的威胁世界
动物卫生组织和日本的资料,都采用病毒分离鉴定,免疫荧光试验,血凝抑制试验,补体结合试验,血清
中和试验等进行诊断我国对木病的研究报道较多,而比较常用的诊断方法仍是本标准规定的病毒分离
鉴定,血凝抑制试验,补体结合试验病毒分离鉴定适用于流行性乙型脑炎新疫区的确定和病畜的确诊.
间接免疫荧光试验适用于可疑流行性乙型脑炎病毒标本的快速检测和病毒分离株的初步鉴定.补体结
合试验,由于补体结合抗体一般在病后2-3周出现,5-6周达高峰,并可维持1年以L,故可适用于流
行性乙A9脑炎的较早期诊断和流行病学调查,是最常用的方法.根据当时的实际需要,可任选一种或两
种检疫方法.以达到准确诊断的卜!的.
本标准的实施,对提高乙型脑炎的诊断和疫情预测水平,及时采取防制措施,保证人畜健康,将起到
重要的作用.
本标准的附录A,附录B都是标准的附录
本标准由,!,华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口.
本标准起草单位:中国人民解放军农牧大学.
本标准主要起草人:李佑民,宣华,李金中,刘振润.
中华人民共和国国家标准
流行性乙型脑炎诊断技术GB/''r 18638--2002
Diagnostic techniques for epidemic encephalitis B
范围本标准规定了流行性乙型脑炎的病毒分离与鉴定,间接免疫荧光试验,补体结合试验,血凝抑制试
验等技术要求
本标准适用于l-1岸,产地及集散地,饲养单位(或个人)的猪,马,骡,驴,牛,羊等的流行性乙型脑炎
的诊断和检疫
2病毒的分离与鉴定
2门材料准备
2门门器材:细胞培养瓶〔或管),吸管.中试管,三角烧瓶,37 C水浴箱,37 C恒温箱,普通冰箱及低温冰
箱,离心机及离心管,研磨器械,普通光学显微镜,G5级玻璃滤器,孔径.. 45 lam的微孔滤膜,0. 25 mL
注射器及针头.
2.1.2试剂:汉克氏(Hanks)4,0.5%水解乳蛋白Hanks液,2万工U/m工青霉素液,2万Ixg/ML.链霉
素液,7%碳酸氢钠液,1%胰蛋白酶液,1%酚红(中性)液,伊格尔氏(Eagle)最低必要成分培养液
(EMEM),小牛血清
2.1.3小动物:小鼠(6 g-8 g),乳鼠
2门.4鸡胚细胞,绿猴肾传代细胞(Vero),仓鼠肾传代细胞(BHK,, ),白蚊伊蚊C6/36传代细胞等.
2-2病毒分离
2.2门样品的采取和运送
2. 2门门在流行的早期和发病的早期(即病毒血症阶段),无菌采取病畜的血液或脑脊髓液.
2.2.1.2应在病畜死亡后3h内(越早越好)采取脑组织(选大脑皮质,脑干,中脑,海马回及桥脑)数小
块放于灭菌玻璃瓶
2.2.1.3猪应采取流产死胎的脑组织,置冰箱内立即送检
2. 2. 1.4不能立即检查者,应放一25 C一一30 C冰箱,或加50%甘油生理盐水,4C保存送检
2.2.2样品的处理
2.2-2. 1血液应分离出血清或血浆.
2.2.2.2脑脊髓液可直接应用.
2. 2. 2. 3脑组织应研磨成糊状,加入0.5%水解乳蛋白Hanks液(或碱性肉汤或10%脱脂奶生理Sh
水),制成10写悬液,3 000 r/min离心30 min,吸取上清液,加入青霉素500 IU /ml和链霉素
500 pg/ml,在4C处理3 h-4 h无污染者可不加青,链霉素处理),即得接种样品.
2.2-2.4
2.2. 3
2.2-3. 1
怀疑有污染的样品,也可用..45 lam微孔滤膜过滤法处理.
动物分离法
取6g-8g小鼠10只(或3-5日龄乳鼠一窝),用左手固定,在耳与眼之间用碘酒消毒右手
持吸取接种样品的0. 25 ml 注射器在消毒部刺人硬堕些互旦生生二竺生燮丝垫些二生鱼塑
中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施
CB/T 18638-2002
0. 01 ml,一..02 ml).然后用左手拇指及食指抓住小鼠头顶部皮肤,翻转左手,使小鼠腹部朝上,将其尾
部夹在左手掌与小手指之间,消毒腹部,右手持注射器向腹腔内注人样品0. 2 m1_-0. 5 m工.
2. 2.3.2对照小鼠2只,按同法同剂量注射稀释液
2.2.13接种后2d--4d,如对照鼠正常,而注射样品的小鼠表现松毛,弓背,沉郁,震颤,绕圈,后肢麻
痹,继而死亡者,应解剖取鼠脑组织,按2. 2. 2. 3制成接种样品,按2. 2.3. 1再接种小鼠.连续2代接种
小鼠均有发病致死者,而且未检出致病细菌时,一方面继续传代并作鉴定,另方面用冰冻干燥法保存
毒种.
2.2.14接种小鼠经7d^14d无一发病时,则取出2只,解剖取脑组织,按2.2. 2.3制成样品4传
代,观察2周如仍无死亡,即按未分离出病毒报告.
2.2.4组织培养法
2.2-4.1取2. 2. 2制成的样品,接种鸡胚细胞,仓鼠肾单层细胞或V ero , BHK aC 6136传代细胞单层,
每份样品至少接种10管(或瓶),每管0. 1 mL^ 0. 2 mL,37C吸附1h,用Hanks液洗1次,加人EMEM
液1 ml,放37 C培养7d-10d.
2. 2.4.2同时设细胞对照2管(或瓶),不接种样品,其他步骤与接种样品管相同
2.2-4. 3接种后观察约10d,第二天开始,每天在显微镜下观察细胞病变,若细胞对照管正常,而接种
样品管细胞出现细胞萎缩,脱落形成空斑等病变时,立即移种新的细胞单层,如出现相类似的病变,且
日渐明显,即可收获,放一25 C一一30 c冰箱保存待检.
2.2.4.4如盲传3代均无细胞病变,即按未分离出病毒报告
22.5鸡胚培养法
2.2. 5门取2.2.2制成的样品,接种于6d-8d龄鸡胚卵黄囊内,每胚接种.. 5 ml,每份样品至少接
种4胚
2. 2. 5. 2同时设对照鸡胚2个,对照鸡胚接种稀释液0. 5 m工J
2.2. 5. 3置37 C培养4 d,48 h后对照鸡胚正常,而接种样品鸡胚死亡或到期未死亡者,解剖取出鸡胚
磨碎,用碱性肉汤制成10 "/o悬液,3 000 x/min离心30 min,取上清液按2.2.3接种小鼠,
2.2-5.4如小鼠发现2. 2. 3. 3中死亡时,解剖取脑组织,冰冻保存待检.
2.2-5.5如鸡胚培养3代均正常,即按未分离出病毒报告
2.2.6病毒的鉴定
经小鼠,鸡胚或组织培养法分离获得能稳定传代的病原,在细菌培养基_L不生长,经除菌过滤((::5
级玻璃滤器或..45 um微孔滤膜)仍保留其繁殖力和致病力,即可以认为已分离到病毒.
2. 2. 6门初步鉴定:将待检病毒制备抗原,用血凝抑制试验(第4章卜补体结合试验(第5章)作初步鉴
定,确定病毒的属性.三种方法任选一种.
2.2-6.2最后鉴定:小鼠中和试验方法如下:
a)首先将被检血清56 C30 min灭活;
b)与10倍连续稀释的乙型脑炎病毒等量混合,在37 C感作I h;
.)给3周龄小鼠脑内接种,每只接种..03 mL,每一稀释度病毒脑内接种相同小鼠5只,观察2周;
d)根据各稀释度小鼠的死亡数和存活数按半数致死量((Reed-Muench)法计算LDs,;
.)操作中要设①病毒对照组(已知参考病毒加阴性血清),②阳性血清对照组(已知参考病毒加阳
性血清);
f)试验组为③(被检病毒加阳性血清);
9)结果判定:
组①LD.:-组②I.Dso=阳性血清中和已知参考病毒的中和指数;
组①工_D一组③LD.二阳性血清中和被检病毒的中和指数
两者中和指数相接近(相差<O. 51,1),,,) ,即可确定分离的病毒为流行性乙型脑炎病毒如对中和指
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数结果有怀疑,可用新分离的病毒制备免疫血清,再与参考株和新分离的病毒株进行交叉中和试验.如
果对应的杭原抗体反应效价高于交叉反应的效价,则表明两者有区别
3补体结合试验
3.1材料准备
3门门器材
试管(7.Sem X 1. 0 cm),吸管(10 m工,2 ml1 m丁),试管架,水浴箱(37C~38 C),离心机及离
心管.
3.1.2试剂
31.2.1乙型脑炎抗原将病毒正常对照抗原,均由制标单位提供
11.2.2溶血素:由制标单位提供.效价应1,5 000以上
31.2.3补体:由制标单位提供冻干补体,或用3只以上豚鼠血清混合的新鲜补体.
11.2.4绵羊红细胞:由健康绵羊采血,加人三倍的阿氏液(见附录A中A3)内,4C保存可用1个月.
用前取绵羊红细胞悬液适量,加5^-10倍量的生理盐水(见附录A中A4),充分混匀后,以2 500 r/min
离心15 min,吸弃t清液后,再加生理盐水悬浮红细胞,如此洗涤3次.最后以2 500 r/min离心20 min,
吸弃土清液,沉淀的红细胞以钙镁盐水((4.1.2.7)配成1%绵羊红细胞悬液.
3.1-2.5阳性对照血清由制标单位供应.
3门.2.6阴性对照血清由制标单位供应.
11.2.7钙镁盐水:见附录A中Al.
3门.3样品
11.11被检血清应于发病早期和病后4周各采血1次,分离血清,密装灭菌小瓶,4C冰箱保存或立
即检查
31.3.2采血分离血清过程应无菌操作,防止污染血清须新鲜透明不溶血.
11.13试验前应将阴性血清,阳性血清,被检血清作2倍稀释,随后依动物种类进行不同温度的加热
灭活30 min.豚鼠56C,马58(1-6()(1,人,猴及小鼠60 C,牛,水牛,山羊,狗,猪,仓鼠62 C.骡,驴
63(,一64(,,家兔65(''.
3.2操作方法
3.2. 1预备试验
见附录H(标准的附录).
3.2.2正式试验
I2.2.1操作程序:
il)取3排小试管,每排6支.
n)于第I排的第2-6管内各加钙镁盐水(见附录A中A1)0. 3 ml.,
()2倍稀释的被检血清..l mL于各排第1管.
d)于第1排第2管2倍稀释的被检血清加.. 3 ml.
.)棍匀第1排第2管内容物,吸取0.5 ml,分别加于第2,第3排的第2管,各加.- 1 ml,加于第1
排第3管余下的0. 3 ml-
f)混匀第3管内容物,如上连续稀释并移人第2,第3排的相应管,直到第6管.
g)结果每排形成I:2到1:64稀释度的被检血清,每管含稀释的被检血清.. 1 m工_然后按表1
加人乙脑病毒杭原,或正常对照抗原,钙镁盐水各.. 1 m工,再加2单位的补体..2.工,振摇棍匀后置
4(冰箱过夜,取出后置37 C水浴30 min
h)各管再加致敏绵羊红细胞悬液0. 2 m1.,37 C感作30 min后判定.
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表1正式试验滴加法-L
.}被检血清
(或阴,阳性血
清)的稀释倍数
结果举例
工作价抗原}2单位补体
致敏绵羊
红细胞
阳性
血清
阴性
血清
被检
血清1
被检
血滑2
被检
血清3
一十一一一一一一一十十于
+十布生
+十+十
+++f
十丰十+
1于于丰
(乙脑抗原
曰000
振荡后置骂C水浴寒日,
振荡后置4凸冰箱过夜,取出后置胃C水浴忿
0202树(j202M
:生:8 16 32
64
0.2
0. 2
0.2
0. 2
().2
O202020202侧侧
自乙宁介自''宁LC厂自
曰门00曰曰
(正常对照抗原
1:2
1:4
1:8
:16
:32
:64
0.1
0. 1
0. 1
0. 1
0. 2
0. 1
曰门曰0门0
钙镁盐水对照
0. 2
0. 2
0. 2
0. 2
()2
0. 2
门阳曰曰
816犯刹
3-2-2-2对照
3.2.2.2.1补体对照:取3排小试管,每排4支(共12管).于3排的第1管,第2管,第3管和第4管
中分别加人..05,0.1,0.15和0.2 ml的2单位补体,并追加.. 25 mL,O. 2 ml-,O. 15 ml和.1 ml钙
镁生理盐水,使各管液量均为.. 3 ml.随后于第I排各管中加人病毒抗原,第2排加人正常抗原,第
3排加人钙镁生理盐水,每管0. 1 ml.振摇混匀后,与正式试验管一起置4C冰箱过夜,而后37 C水浴
30 min,再每管加人致敏绵羊红细胞悬液0. 2 m工_,振摇均匀,与正式试验管置37 C水浴中30 min后判
定.补体0. 15 ml,和0. 2 ml_管应完全溶血,0. 1 ml.管50%抑制溶血,0. 05 ml,管应完全抑制溶血
3.2-2-2.2阳性血清对照:按3. 2. 2. 1操作
3.2,2,2.3阴性血清对照:按3. 2. 2. 1操作.
13结果判定
13门结果表示方法见附录B(标准的附录)中B3.4.血清效价以50%抑制溶血(++)为判定终点.正
式试验结果举例中被检血清2的效价为1:8,被检血清3的效价为1,4,
13.2判定试验结果时,各对照管的结果应符合要求 否则试验应重做.
I13患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上,可诊断为流行性乙型脑炎病畜.单份
血清抗体滴度1:16以上,结合临床症状,可诊断为流行性乙型脑炎病畜.1,4可作为马骡感染阳性的
最低抗体滴度.
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4血凝抑制试验
4.1材料准备
4门.1器材
%孔v TI微量血凝板,25 pl移液管及吸头;微量振荡器;自动稀释器或稀释棒;离心机及离心管
4.1.2试剂
生理盐水;0. 4写牛血清白蛋白pH9. 0硼酸缓冲液(HA BS) ; 25坏白陶土悬液;阿氏液(血球保存
液);不同pH磷酸盐缓冲液「见附录A(标准的附录)].
4.1.3鹅红细胞
取无菌的''ml一10 ml注射器及针头一付,从健康鹅的翅静脉无菌采血2 m工一3 ml,随即注人
盛有15 ml左右阿氏液的三角烧瓶内.不时摇动3 min后,置于4C冰箱过夜.次日将红细胞倒人刻度
离心管,平衡后,2 000 r/-in离心5 min,弃上清液,加人10倍量生理盐水充分混匀,2 000 r/min离心
5 min,如此反复3次.第3次用同样速度离心10 min,然后吸尽上清液.再用1 ml吸管插人离心管内
的红细胞泥的中心部,吸取所需的红细胞,通过对不同pH值的磷酸盐缓冲液(见附录A中A6)试验,选
取最适pH的磷酸盐缓冲液配成.. 33%和8%的鹅红细胞悬液备用.
4门.4血凝素
由制标单位提供,其效价的测定见附录c(标准的附录).
4门.5样品的采集及处理
应于发病旱期和病后3^4周各采血1次,分离血清,立即检查或4C冰箱保存待检.
试验前,被检血清作如卜处理,以除去非特异性血凝抑制物质和非特异性凝集素.取被检血清
..1 ml加pH7. 4磷酸盐缓冲液(见附录A中A6)0.4 in工一,而后加热灭能,灭能温度同补体结合试验的
被检血清的处理(3.1.3.3),灭能后加25%白陶土悬液(见附录A中A5)0.5 ml,用力振荡摇匀,置
37 C1 h或室温过夜后,1 000 r/min离心5 min.取上清液再加8%鹅红细胞悬液..05 m工,混匀后,置
37 C30 min, 1 000 r/min离心5 min,上清液即为1:10稀释的被检血清.
同时检查血清中的免疫球蛋白M (IgM)时,应另取被检血清0. 1 ml,加pH7. 4磷酸盐缓冲液
0. 4m1_, 70 C加热30 min,而后按上述方法处理
阳性血清和阴性血清亦需同样处理
4.2操作方法
4. 2门8单位血凝素的配制:如测定的血凝素效价为1 280倍,则用预冷的.. 4%pH9..的硼酸缓冲液
(见附录A中八2)将血凝素原液作160倍稀释
4.2.2在微量血凝板的第1排(横)各孔的上边分别标记被检血清号,阴性血清号,阳性血清号第1行
(纵)各孔的外侧边标记血清的稀释度.最后一排作红细胞对照.
4.2.3第2排到第7排各孔加人0. 4 %pH9. 0的硼酸缓冲液25 p1.第8排加50 VI.
4.2-4第1,2排按已标记的血清号每孔分别加相应的血清25 IA
4.2. 5 E`l动稀释器,先经生理盐水预温,并排净液体,插人第2排各孔,充分混合后,蘸取25 1,1到第3
排,依次倍比稀释至第7排,最后从第7排各孔中蘸取25川J弃去,第8排作红细胞对照
4.2.6除第8排外,各孔分别加人8个单位的血凝素25 1I,在微量振荡器r.振荡3 min,置室温
(2()(一25 ( )30 min
4.2. 7各孔分别加人..330/6红细胞悬液25 PI,摇匀后置37 C恒温箱30 min,取ill判定结果
4. 3结果判定
判定时先看对照.当被检血清对照,阴性血清对照和红细胞对照均完全不凝集,血凝素对照除I单
位孔呈"丰十'',或"+"凝集,而8单位孔,4单位孔,2单位孔均完全凝集时即可由前向后逐孔检查被检血
清的抑制效价以能完全抑制红细胞凝集的被检血清的最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制抗体效价,
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表2(举例)血清的血凝抑制抗体效价为1:160.患畜恢复期血清的血凝抑制抗体效价比急性期的血清
高4倍以卜,或单份血清作免疫球蛋白M Qgm)处理后,处理后血清的抗体效价比处理前的降低2个滴
度以上时,均可诊断为流行性乙型脑炎病畜马骡流行性乙型脑炎感染的血凝抑制抗体最低滴度暂定为
1,40
表2微量血凝抑制试验(举例)沁
血清稀释度10204080160320640红细胞对照
..4%PH9.硼酸缓冲液
10倍稀释血清
8单位血凝素;:
252525
252525
252525
252525
252525
252525
50
振荡3 min后,置室温30 min
0. 33%鹅红
细胞(PH6. 4)
2525252525252525
摇匀后置37 C恒温箱30 min
判定结果+十++++
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附录A
(标准的附录)
试剂的配制
A1钙镁溶液(用于补体结合试验)
氯化镁(Mgcl 61,0) 10.0g
氯化钙(CaCl, 2H20) 4. 0 g
加蒸馏水至100 ml., 105 kPa 20 min高压灭菌.
A2 0.4%牛血清白蛋白PH9. 0硼酸缓冲液(BABS)(用于血凝抑制试验)
母液1 ;0.05 mol/I硼砂溶液
硼砂(Na7B407.12H,O) 5.2 g
双蒸馏水或无离子水加至250 mI,
母液I:..2 mol/I硼酸溶液
硼酸(H,BO)1. 2 g
加双蒸馏水或无离子水至100 MI.
使用液母液1 32 ml+母液1 8 mL+生理盐水460 m工一配好后测定pH,如不到9.0,可加适量
0. 05 mol八硼砂溶液.105 kPa 20 min高压灭菌.临用前,在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白.
A3阿氏液(用于血凝抑制试验和补体结合试验)
q介日
葡萄糖
柠檬酸钠
氯化钠(NaCI)
加双蒸馏水或无离子水至100 ml-,56
.05 g8g
0. 4 2 g
kPa 20 min高压灭菌
A4生理盐水(用于补体结合试验和血凝抑制试验)
氯化钠(NaCO 8. 5 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 mL,105 kPa 20 min高压灭菌.
A5 25%白陶土悬液(用于血凝抑制试验)
取优质白陶土粉末25 g,加pH7. 4磷酸盐缓冲液至100 m1.,105 kPa 20 min高压灭菌4C保存,可
用1个月.临用前摇匀.
A6不同PH值磷酸盐缓冲液(PBS)
毋液I ;1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液配制
无水磷酸氢二钠9. 47 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 ml,
母液1 :1/15 mol/I磷酸二氢钾溶液配制
磷酸二氢钾9. 08 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 ml.
1,H5.8 PBS母液1 8. 0 ML+母液1 92 ml+生理盐水566 mL;
t4]
GB/T 18638一2002
pH6. 0 PBS:母液1 12. 2 ml+母液.87.8 ml十生理盐水566 ml;
pH6_ 2 PBS:母液1 18. 6 ml, 4-母液0 81.4 ml,生理盐水566 mL;
pH6.4 PBS:母液1 26. ml+母液.73. 3 nil,+生理盐水566 ml;
pH6. 6 PBS:母液工37. 5 to工+母液〔62.sml+生理盐水566 ml;
f)147.4 PISS:付液1 80. 8 ml, +q液0 19. 2 ml十生理盐水566 ml
校1l: t,H值后.105 kPa 20 min高压灭菌
附录B
(标准的附录)
补体结合试验的预备试验
B1溶血素效价滴定
B1. 1溶血素的稀释:吸取溶血素.1 ml,(含50%甘油者用0. 2 mL),加钙镁盐水9.9 ml(含50%甘
油者加9.8 ML),混匀后即为I-100的溶血素,然后取1:100溶血素I mL加钙镁盐水4 nil,,即为
1:500的溶血素.再按表B1进行稀释
表B1溶血素的稀释
川2溶血素的滴定:取一支1 ml吸管,由高稀释度开始,将各管已稀释的溶血素吸到另一排小试管
内,每管0. 1 ml,然后按表112依次加人补体,钙镁盐水及I写绵羊红细胞,摇匀后,置37C水浴中
30 min,观察结果.
表BZ溶血素的滴定
试管号
溶血素
补体(I:50)
ml
钙镁盐水
ml
1%绵羊红细胞悬液
ml
擂匀后
置37C
水浴中
30 mm
结果
全溶
全溶
全溶 全溶
全溶
全溶
人部分溶解
微溶 个溶 不济
稀释度
ml.0.2
O2
0.2
0. 2
0. 2
02
0.2
0.2
0.2
()2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0. 1
0.1
〔〕.飞
(〕.1
l23456r8g1O
]:1 000
I:2 000
1:3 000
It.忿.〔)0
I:岛.()()
1;C, 000
1:''r 000
I:8 000
1:9 NO
飞乍,自000
0. 1
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n. I
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o. z
o. z
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O2
0.2
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0.z
Oz
ljZ
GBIT 18638-2002
川3溶血素单位计算能使红细胞完全溶解的溶血素的最高稀释度称为1个溶血素单位.表名中判
定结果为第6管,即.1 ml, 1 : 6 000的溶血素含有工个单位.试验中应用2个单位的溶血素.即将溶
血索稀释成1:3 000则0. 1 ml中含有2个单位溶血素.
补体效价滴定
1滴定方法吸取补体.. 1 ml,加钙镁盐水4.9 ml即1!
排小试管中,再依次加人钙镁盐水,4个单位溶血素或150稀释补体,然后按表
二5稀释抗原,混匀后
mm.再加人致敏绵羊红细胞(1%绵羊红细胞悬液与等量2个单位溶血素相混合
133的量分别加
,放37C水浴中
,放37 C水浴中
B2.2】,,),摇匀后,放37C水浴中30 min,观察结果
补体单位的计算:能使红细胞完全溶解的最小补体量为一个单位,正式试验和抗原滴定时都用2
112BZ入拍15个单位的补体.如表B3所示,0. 12 ml的1:50补体为一个单位2个单位补体应为.. 24 ml的1:50
补体由于正式试验和抗原滴定时每管应加的补体量为0. 2 m L,故需按式(BI)换算其稀释度:
X二
(50X0. 2 )
0.24
41 . . , . .. .一(B1)
将未稀释补体稀释成1:41即可使.2 ml内含2个单位的补体.具体方法是在1 mL补体内加
40 ml钙镁盐水,即为1:41稀释.
表B3补体效价的滴定
I{;PfdmL 稀释抗原
}
钙镁盐水
ml
放置
37(
水浴中
30 min
致敏红细胞
.I-
放置
37(-
水浴中
30mln
结果举例
不馆 微溶
微不溶
全溶 全溶
全溶 不溶
微溶
微不溶
全溶
全溶
全溶
不溶微溶
微不溶
全溶全溶
全溶
病毒抗原
一一一一一一
正常脑组织对照抗原
一一一一一一
盐水对照
一一一一一一
0. 2
0,2
02
0- 2
0,2
0.2
O2
0. 2
0. 2
0_2
Oz
0. 2
0. 2
0.2
0.2
0. 2
02
0_2
GB/T 18638-2002
B3病毒抗原效价的滴定
抗原滴定一般按方阵法进行,即用倍比稀释的已知阳性血清与倍比稀释的抗原进行试验
进行抗原和血清稀释,表中举例说明效价滴定结果.
B3.1滴定方法
按表4纵横排列试管,分别加人稀释的抗原和免疫血清各0. 1 ml.每管加人稀释补体..
2个单位).
表B4抗原效价滴定(举例)
按表134
ml(含
免疫血清
病毒抗原
病毒抗原
抗补体对照
:16}1:32 11:64一1:128
正常血清(1,4)
抗补体对照
}一附+{++I-+I++++I+-i-++一+十十+
卜+++}++斗一+}++十+一+十++一+++十
斗朴+
十+十
斗+生.飞
卜+汁一仁一仲十十一下+十
1:16
1:32
1:64
1:128
正常抗原Cl:1)抗
补体对照免疫血清
抗补体对照
++++}十十++}++++
+丰
++ 朴十
++
卜+朴+ 干+
++
乍十+
++
B3.2对照管设置
B3.2. 1免疫血清抗补体对照:将免疫血清稀释为1::8,每管0. 1 ml,每个稀释度再加人
钙镁盐水..1m工,稀释补体..2 ml,但不加抗原.
B3. 2. 2病毒抗原抗补体对照:将病毒抗原稀释为I:2,1:4,1:8,每管各加..l ml,再加钙镁盐水
0. 1 ml,稀释补体..2 ml,,
B3. 2. 3正常血清抗补体对照:在7管1:4正常血清0. 1 ml中,分别加人不同稀释度的病毒抗原
0. 1 m工,稀释补体0. 2 m工.
B3.2. 4正常抗原抗补体对照:在7管1:4正常抗原..1 ml中,分别加人不同稀释度的免疫血清
0. 1 ml,稀释补体0. 2 ml.
B3. 2. 5溶血素对照:加钙镁盐水.. 4 ml一于1支小试管中.
B3.3感作
将各管摇匀,置4C冰箱内过夜,次日取出,放于37 C水浴中30 min,每管加人致敏绵羊红细胞悬液
0. 2 ml,,置37 C水浴内30 min,判定结果.
B3.4结果判定
完全抑制溶血者为"十++十",75%抑制溶血者为"斗一+十",50%抑制溶血者为"十十",25%抑制
溶血者为"+",完全不抑制溶血者为"一".与最高稀释度免疫血清发生100%或75%抑制溶血的抗原,
其抗原的最高稀释倍数就是抗原的效价表B4举例为1:32.正式试验时须用较高浓度(约4-8倍)的
抗原,一般用抗原原液的1:4或1,8稀释液.
391389
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前台
流行性乙1q''j脑炎又称日本乙型脑炎((Japanese B encephalitic),是山流行性乙NUR炎病毒引起的一
种蚊媒性人兽共患传染病成年动物和人常呈隐性感染,幼龄动物特别是马感染后,可发生脑炎症状.妊
娠母猪可引起流产,死胎及木乃伊胎,公猪翠丸肿大,儿童可发生严重的脑炎.多发生于7- 9月份.我
国许多省(Ili )都有本病发生,特别是六t -f年代,发病率最高.对人畜的健康可造成严重的威胁世界
动物卫生组织和日本的资料,都采用病毒分离鉴定,免疫荧光试验,血凝抑制试验,补体结合试验,血清
中和试验等进行诊断我国对木病的研究报道较多,而比较常用的诊断方法仍是本标准规定的病毒分离
鉴定,血凝抑制试验,补体结合试验病毒分离鉴定适用于流行性乙型脑炎新疫区的确定和病畜的确诊.
间接免疫荧光试验适用于可疑流行性乙型脑炎病毒标本的快速检测和病毒分离株的初步鉴定.补体结
合试验,由于补体结合抗体一般在病后2-3周出现,5-6周达高峰,并可维持1年以L,故可适用于流
行性乙A9脑炎的较早期诊断和流行病学调查,是最常用的方法.根据当时的实际需要,可任选一种或两
种检疫方法.以达到准确诊断的卜!的.
本标准的实施,对提高乙型脑炎的诊断和疫情预测水平,及时采取防制措施,保证人畜健康,将起到
重要的作用.
本标准的附录A,附录B都是标准的附录
本标准由,!,华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口.
本标准起草单位:中国人民解放军农牧大学.
本标准主要起草人:李佑民,宣华,李金中,刘振润.
中华人民共和国国家标准
流行性乙型脑炎诊断技术GB/''r 18638--2002
Diagnostic techniques for epidemic encephalitis B
范围本标准规定了流行性乙型脑炎的病毒分离与鉴定,间接免疫荧光试验,补体结合试验,血凝抑制试
验等技术要求
本标准适用于l-1岸,产地及集散地,饲养单位(或个人)的猪,马,骡,驴,牛,羊等的流行性乙型脑炎
的诊断和检疫
2病毒的分离与鉴定
2门材料准备
2门门器材:细胞培养瓶〔或管),吸管.中试管,三角烧瓶,37 C水浴箱,37 C恒温箱,普通冰箱及低温冰
箱,离心机及离心管,研磨器械,普通光学显微镜,G5级玻璃滤器,孔径.. 45 lam的微孔滤膜,0. 25 mL
注射器及针头.
2.1.2试剂:汉克氏(Hanks)4,0.5%水解乳蛋白Hanks液,2万工U/m工青霉素液,2万Ixg/ML.链霉
素液,7%碳酸氢钠液,1%胰蛋白酶液,1%酚红(中性)液,伊格尔氏(Eagle)最低必要成分培养液
(EMEM),小牛血清
2.1.3小动物:小鼠(6 g-8 g),乳鼠
2门.4鸡胚细胞,绿猴肾传代细胞(Vero),仓鼠肾传代细胞(BHK,, ),白蚊伊蚊C6/36传代细胞等.
2-2病毒分离
2.2门样品的采取和运送
2. 2门门在流行的早期和发病的早期(即病毒血症阶段),无菌采取病畜的血液或脑脊髓液.
2.2.1.2应在病畜死亡后3h内(越早越好)采取脑组织(选大脑皮质,脑干,中脑,海马回及桥脑)数小
块放于灭菌玻璃瓶
2.2.1.3猪应采取流产死胎的脑组织,置冰箱内立即送检
2. 2. 1.4不能立即检查者,应放一25 C一一30 C冰箱,或加50%甘油生理盐水,4C保存送检
2.2.2样品的处理
2.2-2. 1血液应分离出血清或血浆.
2.2.2.2脑脊髓液可直接应用.
2. 2. 2. 3脑组织应研磨成糊状,加入0.5%水解乳蛋白Hanks液(或碱性肉汤或10%脱脂奶生理Sh
水),制成10写悬液,3 000 r/min离心30 min,吸取上清液,加入青霉素500 IU /ml和链霉素
500 pg/ml,在4C处理3 h-4 h无污染者可不加青,链霉素处理),即得接种样品.
2.2-2.4
2.2. 3
2.2-3. 1
怀疑有污染的样品,也可用..45 lam微孔滤膜过滤法处理.
动物分离法
取6g-8g小鼠10只(或3-5日龄乳鼠一窝),用左手固定,在耳与眼之间用碘酒消毒右手
持吸取接种样品的0. 25 ml 注射器在消毒部刺人硬堕些互旦生生二竺生燮丝垫些二生鱼塑
中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施
CB/T 18638-2002
0. 01 ml,一..02 ml).然后用左手拇指及食指抓住小鼠头顶部皮肤,翻转左手,使小鼠腹部朝上,将其尾
部夹在左手掌与小手指之间,消毒腹部,右手持注射器向腹腔内注人样品0. 2 m1_-0. 5 m工.
2. 2.3.2对照小鼠2只,按同法同剂量注射稀释液
2.2.13接种后2d--4d,如对照鼠正常,而注射样品的小鼠表现松毛,弓背,沉郁,震颤,绕圈,后肢麻
痹,继而死亡者,应解剖取鼠脑组织,按2. 2. 2. 3制成接种样品,按2. 2.3. 1再接种小鼠.连续2代接种
小鼠均有发病致死者,而且未检出致病细菌时,一方面继续传代并作鉴定,另方面用冰冻干燥法保存
毒种.
2.2.14接种小鼠经7d^14d无一发病时,则取出2只,解剖取脑组织,按2.2. 2.3制成样品4传
代,观察2周如仍无死亡,即按未分离出病毒报告.
2.2.4组织培养法
2.2-4.1取2. 2. 2制成的样品,接种鸡胚细胞,仓鼠肾单层细胞或V ero , BHK aC 6136传代细胞单层,
每份样品至少接种10管(或瓶),每管0. 1 mL^ 0. 2 mL,37C吸附1h,用Hanks液洗1次,加人EMEM
液1 ml,放37 C培养7d-10d.
2. 2.4.2同时设细胞对照2管(或瓶),不接种样品,其他步骤与接种样品管相同
2.2-4. 3接种后观察约10d,第二天开始,每天在显微镜下观察细胞病变,若细胞对照管正常,而接种
样品管细胞出现细胞萎缩,脱落形成空斑等病变时,立即移种新的细胞单层,如出现相类似的病变,且
日渐明显,即可收获,放一25 C一一30 c冰箱保存待检.
2.2.4.4如盲传3代均无细胞病变,即按未分离出病毒报告
22.5鸡胚培养法
2.2. 5门取2.2.2制成的样品,接种于6d-8d龄鸡胚卵黄囊内,每胚接种.. 5 ml,每份样品至少接
种4胚
2. 2. 5. 2同时设对照鸡胚2个,对照鸡胚接种稀释液0. 5 m工J
2.2. 5. 3置37 C培养4 d,48 h后对照鸡胚正常,而接种样品鸡胚死亡或到期未死亡者,解剖取出鸡胚
磨碎,用碱性肉汤制成10 "/o悬液,3 000 x/min离心30 min,取上清液按2.2.3接种小鼠,
2.2-5.4如小鼠发现2. 2. 3. 3中死亡时,解剖取脑组织,冰冻保存待检.
2.2-5.5如鸡胚培养3代均正常,即按未分离出病毒报告
2.2.6病毒的鉴定
经小鼠,鸡胚或组织培养法分离获得能稳定传代的病原,在细菌培养基_L不生长,经除菌过滤((::5
级玻璃滤器或..45 um微孔滤膜)仍保留其繁殖力和致病力,即可以认为已分离到病毒.
2. 2. 6门初步鉴定:将待检病毒制备抗原,用血凝抑制试验(第4章卜补体结合试验(第5章)作初步鉴
定,确定病毒的属性.三种方法任选一种.
2.2-6.2最后鉴定:小鼠中和试验方法如下:
a)首先将被检血清56 C30 min灭活;
b)与10倍连续稀释的乙型脑炎病毒等量混合,在37 C感作I h;
.)给3周龄小鼠脑内接种,每只接种..03 mL,每一稀释度病毒脑内接种相同小鼠5只,观察2周;
d)根据各稀释度小鼠的死亡数和存活数按半数致死量((Reed-Muench)法计算LDs,;
.)操作中要设①病毒对照组(已知参考病毒加阴性血清),②阳性血清对照组(已知参考病毒加阳
性血清);
f)试验组为③(被检病毒加阳性血清);
9)结果判定:
组①LD.:-组②I.Dso=阳性血清中和已知参考病毒的中和指数;
组①工_D一组③LD.二阳性血清中和被检病毒的中和指数
两者中和指数相接近(相差<O. 51,1),,,) ,即可确定分离的病毒为流行性乙型脑炎病毒如对中和指
Ge/T 18638-2002
数结果有怀疑,可用新分离的病毒制备免疫血清,再与参考株和新分离的病毒株进行交叉中和试验.如
果对应的杭原抗体反应效价高于交叉反应的效价,则表明两者有区别
3补体结合试验
3.1材料准备
3门门器材
试管(7.Sem X 1. 0 cm),吸管(10 m工,2 ml1 m丁),试管架,水浴箱(37C~38 C),离心机及离
心管.
3.1.2试剂
31.2.1乙型脑炎抗原将病毒正常对照抗原,均由制标单位提供
11.2.2溶血素:由制标单位提供.效价应1,5 000以上
31.2.3补体:由制标单位提供冻干补体,或用3只以上豚鼠血清混合的新鲜补体.
11.2.4绵羊红细胞:由健康绵羊采血,加人三倍的阿氏液(见附录A中A3)内,4C保存可用1个月.
用前取绵羊红细胞悬液适量,加5^-10倍量的生理盐水(见附录A中A4),充分混匀后,以2 500 r/min
离心15 min,吸弃t清液后,再加生理盐水悬浮红细胞,如此洗涤3次.最后以2 500 r/min离心20 min,
吸弃土清液,沉淀的红细胞以钙镁盐水((4.1.2.7)配成1%绵羊红细胞悬液.
3.1-2.5阳性对照血清由制标单位供应.
3门.2.6阴性对照血清由制标单位供应.
11.2.7钙镁盐水:见附录A中Al.
3门.3样品
11.11被检血清应于发病早期和病后4周各采血1次,分离血清,密装灭菌小瓶,4C冰箱保存或立
即检查
31.3.2采血分离血清过程应无菌操作,防止污染血清须新鲜透明不溶血.
11.13试验前应将阴性血清,阳性血清,被检血清作2倍稀释,随后依动物种类进行不同温度的加热
灭活30 min.豚鼠56C,马58(1-6()(1,人,猴及小鼠60 C,牛,水牛,山羊,狗,猪,仓鼠62 C.骡,驴
63(,一64(,,家兔65(''.
3.2操作方法
3.2. 1预备试验
见附录H(标准的附录).
3.2.2正式试验
I2.2.1操作程序:
il)取3排小试管,每排6支.
n)于第I排的第2-6管内各加钙镁盐水(见附录A中A1)0. 3 ml.,
()2倍稀释的被检血清..l mL于各排第1管.
d)于第1排第2管2倍稀释的被检血清加.. 3 ml.
.)棍匀第1排第2管内容物,吸取0.5 ml,分别加于第2,第3排的第2管,各加.- 1 ml,加于第1
排第3管余下的0. 3 ml-
f)混匀第3管内容物,如上连续稀释并移人第2,第3排的相应管,直到第6管.
g)结果每排形成I:2到1:64稀释度的被检血清,每管含稀释的被检血清.. 1 m工_然后按表1
加人乙脑病毒杭原,或正常对照抗原,钙镁盐水各.. 1 m工,再加2单位的补体..2.工,振摇棍匀后置
4(冰箱过夜,取出后置37 C水浴30 min
h)各管再加致敏绵羊红细胞悬液0. 2 m1.,37 C感作30 min后判定.
GB/T 18638-2002
表1正式试验滴加法-L
.}被检血清
(或阴,阳性血
清)的稀释倍数
结果举例
工作价抗原}2单位补体
致敏绵羊
红细胞
阳性
血清
阴性
血清
被检
血清1
被检
血滑2
被检
血清3
一十一一一一一一一十十于
+十布生
+十+十
+++f
十丰十+
1于于丰
(乙脑抗原
曰000
振荡后置骂C水浴寒日,
振荡后置4凸冰箱过夜,取出后置胃C水浴忿
0202树(j202M
:生:8 16 32
64
0.2
0. 2
0.2
0. 2
().2
O202020202侧侧
自乙宁介自''宁LC厂自
曰门00曰曰
(正常对照抗原
1:2
1:4
1:8
:16
:32
:64
0.1
0. 1
0. 1
0. 1
0. 2
0. 1
曰门曰0门0
钙镁盐水对照
0. 2
0. 2
0. 2
0. 2
()2
0. 2
门阳曰曰
816犯刹
3-2-2-2对照
3.2.2.2.1补体对照:取3排小试管,每排4支(共12管).于3排的第1管,第2管,第3管和第4管
中分别加人..05,0.1,0.15和0.2 ml的2单位补体,并追加.. 25 mL,O. 2 ml-,O. 15 ml和.1 ml钙
镁生理盐水,使各管液量均为.. 3 ml.随后于第I排各管中加人病毒抗原,第2排加人正常抗原,第
3排加人钙镁生理盐水,每管0. 1 ml.振摇混匀后,与正式试验管一起置4C冰箱过夜,而后37 C水浴
30 min,再每管加人致敏绵羊红细胞悬液0. 2 m工_,振摇均匀,与正式试验管置37 C水浴中30 min后判
定.补体0. 15 ml,和0. 2 ml_管应完全溶血,0. 1 ml.管50%抑制溶血,0. 05 ml,管应完全抑制溶血
3.2-2-2.2阳性血清对照:按3. 2. 2. 1操作
3.2,2,2.3阴性血清对照:按3. 2. 2. 1操作.
13结果判定
13门结果表示方法见附录B(标准的附录)中B3.4.血清效价以50%抑制溶血(++)为判定终点.正
式试验结果举例中被检血清2的效价为1:8,被检血清3的效价为1,4,
13.2判定试验结果时,各对照管的结果应符合要求 否则试验应重做.
I13患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上,可诊断为流行性乙型脑炎病畜.单份
血清抗体滴度1:16以上,结合临床症状,可诊断为流行性乙型脑炎病畜.1,4可作为马骡感染阳性的
最低抗体滴度.
GB/''r 18638-2002
4血凝抑制试验
4.1材料准备
4门.1器材
%孔v TI微量血凝板,25 pl移液管及吸头;微量振荡器;自动稀释器或稀释棒;离心机及离心管
4.1.2试剂
生理盐水;0. 4写牛血清白蛋白pH9. 0硼酸缓冲液(HA BS) ; 25坏白陶土悬液;阿氏液(血球保存
液);不同pH磷酸盐缓冲液「见附录A(标准的附录)].
4.1.3鹅红细胞
取无菌的''ml一10 ml注射器及针头一付,从健康鹅的翅静脉无菌采血2 m工一3 ml,随即注人
盛有15 ml左右阿氏液的三角烧瓶内.不时摇动3 min后,置于4C冰箱过夜.次日将红细胞倒人刻度
离心管,平衡后,2 000 r/-in离心5 min,弃上清液,加人10倍量生理盐水充分混匀,2 000 r/min离心
5 min,如此反复3次.第3次用同样速度离心10 min,然后吸尽上清液.再用1 ml吸管插人离心管内
的红细胞泥的中心部,吸取所需的红细胞,通过对不同pH值的磷酸盐缓冲液(见附录A中A6)试验,选
取最适pH的磷酸盐缓冲液配成.. 33%和8%的鹅红细胞悬液备用.
4门.4血凝素
由制标单位提供,其效价的测定见附录c(标准的附录).
4门.5样品的采集及处理
应于发病旱期和病后3^4周各采血1次,分离血清,立即检查或4C冰箱保存待检.
试验前,被检血清作如卜处理,以除去非特异性血凝抑制物质和非特异性凝集素.取被检血清
..1 ml加pH7. 4磷酸盐缓冲液(见附录A中A6)0.4 in工一,而后加热灭能,灭能温度同补体结合试验的
被检血清的处理(3.1.3.3),灭能后加25%白陶土悬液(见附录A中A5)0.5 ml,用力振荡摇匀,置
37 C1 h或室温过夜后,1 000 r/min离心5 min.取上清液再加8%鹅红细胞悬液..05 m工,混匀后,置
37 C30 min, 1 000 r/min离心5 min,上清液即为1:10稀释的被检血清.
同时检查血清中的免疫球蛋白M (IgM)时,应另取被检血清0. 1 ml,加pH7. 4磷酸盐缓冲液
0. 4m1_, 70 C加热30 min,而后按上述方法处理
阳性血清和阴性血清亦需同样处理
4.2操作方法
4. 2门8单位血凝素的配制:如测定的血凝素效价为1 280倍,则用预冷的.. 4%pH9..的硼酸缓冲液
(见附录A中八2)将血凝素原液作160倍稀释
4.2.2在微量血凝板的第1排(横)各孔的上边分别标记被检血清号,阴性血清号,阳性血清号第1行
(纵)各孔的外侧边标记血清的稀释度.最后一排作红细胞对照.
4.2.3第2排到第7排各孔加人0. 4 %pH9. 0的硼酸缓冲液25 p1.第8排加50 VI.
4.2-4第1,2排按已标记的血清号每孔分别加相应的血清25 IA
4.2. 5 E`l动稀释器,先经生理盐水预温,并排净液体,插人第2排各孔,充分混合后,蘸取25 1,1到第3
排,依次倍比稀释至第7排,最后从第7排各孔中蘸取25川J弃去,第8排作红细胞对照
4.2.6除第8排外,各孔分别加人8个单位的血凝素25 1I,在微量振荡器r.振荡3 min,置室温
(2()(一25 ( )30 min
4.2. 7各孔分别加人..330/6红细胞悬液25 PI,摇匀后置37 C恒温箱30 min,取ill判定结果
4. 3结果判定
判定时先看对照.当被检血清对照,阴性血清对照和红细胞对照均完全不凝集,血凝素对照除I单
位孔呈"丰十'',或"+"凝集,而8单位孔,4单位孔,2单位孔均完全凝集时即可由前向后逐孔检查被检血
清的抑制效价以能完全抑制红细胞凝集的被检血清的最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制抗体效价,
GB/T 18638-2002
表2(举例)血清的血凝抑制抗体效价为1:160.患畜恢复期血清的血凝抑制抗体效价比急性期的血清
高4倍以卜,或单份血清作免疫球蛋白M Qgm)处理后,处理后血清的抗体效价比处理前的降低2个滴
度以上时,均可诊断为流行性乙型脑炎病畜马骡流行性乙型脑炎感染的血凝抑制抗体最低滴度暂定为
1,40
表2微量血凝抑制试验(举例)沁
血清稀释度10204080160320640红细胞对照
..4%PH9.硼酸缓冲液
10倍稀释血清
8单位血凝素;:
252525
252525
252525
252525
252525
252525
50
振荡3 min后,置室温30 min
0. 33%鹅红
细胞(PH6. 4)
2525252525252525
摇匀后置37 C恒温箱30 min
判定结果+十++++
GB/T 18638--2002
附录A
(标准的附录)
试剂的配制
A1钙镁溶液(用于补体结合试验)
氯化镁(Mgcl 61,0) 10.0g
氯化钙(CaCl, 2H20) 4. 0 g
加蒸馏水至100 ml., 105 kPa 20 min高压灭菌.
A2 0.4%牛血清白蛋白PH9. 0硼酸缓冲液(BABS)(用于血凝抑制试验)
母液1 ;0.05 mol/I硼砂溶液
硼砂(Na7B407.12H,O) 5.2 g
双蒸馏水或无离子水加至250 mI,
母液I:..2 mol/I硼酸溶液
硼酸(H,BO)1. 2 g
加双蒸馏水或无离子水至100 MI.
使用液母液1 32 ml+母液1 8 mL+生理盐水460 m工一配好后测定pH,如不到9.0,可加适量
0. 05 mol八硼砂溶液.105 kPa 20 min高压灭菌.临用前,在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白.
A3阿氏液(用于血凝抑制试验和补体结合试验)
q介日
葡萄糖
柠檬酸钠
氯化钠(NaCI)
加双蒸馏水或无离子水至100 ml-,56
.05 g8g
0. 4 2 g
kPa 20 min高压灭菌
A4生理盐水(用于补体结合试验和血凝抑制试验)
氯化钠(NaCO 8. 5 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 mL,105 kPa 20 min高压灭菌.
A5 25%白陶土悬液(用于血凝抑制试验)
取优质白陶土粉末25 g,加pH7. 4磷酸盐缓冲液至100 m1.,105 kPa 20 min高压灭菌4C保存,可
用1个月.临用前摇匀.
A6不同PH值磷酸盐缓冲液(PBS)
毋液I ;1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液配制
无水磷酸氢二钠9. 47 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 ml,
母液1 :1/15 mol/I磷酸二氢钾溶液配制
磷酸二氢钾9. 08 g
加双蒸馏水或无离子水至1 000 ml.
1,H5.8 PBS母液1 8. 0 ML+母液1 92 ml+生理盐水566 mL;
t4]
GB/T 18638一2002
pH6. 0 PBS:母液1 12. 2 ml+母液.87.8 ml十生理盐水566 ml;
pH6_ 2 PBS:母液1 18. 6 ml, 4-母液0 81.4 ml,生理盐水566 mL;
pH6.4 PBS:母液1 26. ml+母液.73. 3 nil,+生理盐水566 ml;
pH6. 6 PBS:母液工37. 5 to工+母液〔62.sml+生理盐水566 ml;
f)147.4 PISS:付液1 80. 8 ml, +q液0 19. 2 ml十生理盐水566 ml
校1l: t,H值后.105 kPa 20 min高压灭菌
附录B
(标准的附录)
补体结合试验的预备试验
B1溶血素效价滴定
B1. 1溶血素的稀释:吸取溶血素.1 ml,(含50%甘油者用0. 2 mL),加钙镁盐水9.9 ml(含50%甘
油者加9.8 ML),混匀后即为I-100的溶血素,然后取1:100溶血素I mL加钙镁盐水4 nil,,即为
1:500的溶血素.再按表B1进行稀释
表B1溶血素的稀释
川2溶血素的滴定:取一支1 ml吸管,由高稀释度开始,将各管已稀释的溶血素吸到另一排小试管
内,每管0. 1 ml,然后按表112依次加人补体,钙镁盐水及I写绵羊红细胞,摇匀后,置37C水浴中
30 min,观察结果.
表BZ溶血素的滴定
试管号
溶血素
补体(I:50)
ml
钙镁盐水
ml
1%绵羊红细胞悬液
ml
擂匀后
置37C
水浴中
30 mm
结果
全溶
全溶
全溶 全溶
全溶
全溶
人部分溶解
微溶 个溶 不济
稀释度
ml.0.2
O2
0.2
0. 2
0. 2
02
0.2
0.2
0.2
()2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0. 1
0.1
〔〕.飞
(〕.1
l23456r8g1O
]:1 000
I:2 000
1:3 000
It.忿.〔)0
I:岛.()()
1;C, 000
1:''r 000
I:8 000
1:9 NO
飞乍,自000
0. 1
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0. 1
0- 1
0. 1
0]
n. I
f〕.t
o. 1
r〕_1
0.z
o. z
o. z
o. z
0.z
O2
0.2
o.2
0.z
Oz
ljZ
GBIT 18638-2002
川3溶血素单位计算能使红细胞完全溶解的溶血素的最高稀释度称为1个溶血素单位.表名中判
定结果为第6管,即.1 ml, 1 : 6 000的溶血素含有工个单位.试验中应用2个单位的溶血素.即将溶
血索稀释成1:3 000则0. 1 ml中含有2个单位溶血素.
补体效价滴定
1滴定方法吸取补体.. 1 ml,加钙镁盐水4.9 ml即1!
排小试管中,再依次加人钙镁盐水,4个单位溶血素或150稀释补体,然后按表
二5稀释抗原,混匀后
mm.再加人致敏绵羊红细胞(1%绵羊红细胞悬液与等量2个单位溶血素相混合
133的量分别加
,放37C水浴中
,放37 C水浴中
B2.2】,,),摇匀后,放37C水浴中30 min,观察结果
补体单位的计算:能使红细胞完全溶解的最小补体量为一个单位,正式试验和抗原滴定时都用2
112BZ入拍15个单位的补体.如表B3所示,0. 12 ml的1:50补体为一个单位2个单位补体应为.. 24 ml的1:50
补体由于正式试验和抗原滴定时每管应加的补体量为0. 2 m L,故需按式(BI)换算其稀释度:
X二
(50X0. 2 )
0.24
41 . . , . .. .一(B1)
将未稀释补体稀释成1:41即可使.2 ml内含2个单位的补体.具体方法是在1 mL补体内加
40 ml钙镁盐水,即为1:41稀释.
表B3补体效价的滴定
I{;PfdmL 稀释抗原
}
钙镁盐水
ml
放置
37(
水浴中
30 min
致敏红细胞
.I-
放置
37(-
水浴中
30mln
结果举例
不馆 微溶
微不溶
全溶 全溶
全溶 不溶
微溶
微不溶
全溶
全溶
全溶
不溶微溶
微不溶
全溶全溶
全溶
病毒抗原
一一一一一一
正常脑组织对照抗原
一一一一一一
盐水对照
一一一一一一
0. 2
0,2
02
0- 2
0,2
0.2
O2
0. 2
0. 2
0_2
Oz
0. 2
0. 2
0.2
0.2
0. 2
02
0_2
GB/T 18638-2002
B3病毒抗原效价的滴定
抗原滴定一般按方阵法进行,即用倍比稀释的已知阳性血清与倍比稀释的抗原进行试验
进行抗原和血清稀释,表中举例说明效价滴定结果.
B3.1滴定方法
按表4纵横排列试管,分别加人稀释的抗原和免疫血清各0. 1 ml.每管加人稀释补体..
2个单位).
表B4抗原效价滴定(举例)
按表134
ml(含
免疫血清
病毒抗原
病毒抗原
抗补体对照
:16}1:32 11:64一1:128
正常血清(1,4)
抗补体对照
}一附+{++I-+I++++I+-i-++一+十十+
卜+++}++斗一+}++十+一+十++一+++十
斗朴+
十+十
斗+生.飞
卜+汁一仁一仲十十一下+十
1:16
1:32
1:64
1:128
正常抗原Cl:1)抗
补体对照免疫血清
抗补体对照
++++}十十++}++++
+丰
++ 朴十
++
卜+朴+ 干+
++
乍十+
++
B3.2对照管设置
B3.2. 1免疫血清抗补体对照:将免疫血清稀释为1::8,每管0. 1 ml,每个稀释度再加人
钙镁盐水..1m工,稀释补体..2 ml,但不加抗原.
B3. 2. 2病毒抗原抗补体对照:将病毒抗原稀释为I:2,1:4,1:8,每管各加..l ml,再加钙镁盐水
0. 1 ml,稀释补体..2 ml,,
B3. 2. 3正常血清抗补体对照:在7管1:4正常血清0. 1 ml中,分别加人不同稀释度的病毒抗原
0. 1 m工,稀释补体0. 2 m工.
B3.2. 4正常抗原抗补体对照:在7管1:4正常抗原..1 ml中,分别加人不同稀释度的免疫血清
0. 1 ml,稀释补体0. 2 ml.
B3. 2. 5溶血素对照:加钙镁盐水.. 4 ml一于1支小试管中.
B3.3感作
将各管摇匀,置4C冰箱内过夜,次日取出,放于37 C水浴中30 min,每管加人致敏绵羊红细胞悬液
0. 2 ml,,置37 C水浴内30 min,判定结果.
B3.4结果判定
完全抑制溶血者为"十++十",75%抑制溶血者为"斗一+十",50%抑制溶血者为"十十",25%抑制
溶血者为"+",完全不抑制溶血者为"一".与最高稀释度免疫血清发生100%或75%抑制溶血的抗原,
其抗原的最高稀释倍数就是抗原的效价表B4举例为1:32.正式试验时须用较高浓度(约4-8倍)的
抗原,一般用抗原原液的1:4或1,8稀释液.
391389
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